C-反應蛋白（hsCRP）ELISA檢測原理&分析程序

C-反應蛋白（CRP）ELISA是一種測定CRP的定量免疫測定法，在人血清中。僅供研究使用。不用于診斷或治療程序。

艾美捷C-反應蛋白（hsCRP）ELISA檢測原理：

CRP ELISA是一種兩步捕獲或“夾心”類型的免疫測定。該檢測使用兩種高度特異性的單克隆抗體：一種特異性針對CRP的單克隆抗體固定在微孔板上，另一種針對CRP不同表位的單克隆抗體與辣根過氧化物酶（HRP）結合（HRP結合物）。在第一次孵育步驟中，樣本、校準品和對照品中存在的CRP被固定在微孔板上的抗體所結合。通過洗滌步驟去除多余的和未結合的物質。

在第二次孵育步驟中，添加HRP結合的抗體（HRP結合物），它特異性地結合到任何固定的CRP上，形成夾心復合物。通過洗滌步驟去除未結合的HRP結合物。接下來，添加TMB底物（酶底物）并與HRP反應形成藍色產物，其顏色的深淺與樣本中存在的CRP量成正比。通過添加停止溶液來終止酶促反應，將顏色從藍色變為黃色。在450 nm處使用微孔板讀取器測量吸光度。使用一組校準品繪制校準曲線，從而可以直接讀取樣本和對照品中CRP的含量。

C-反應蛋白（hsCRP）ELISA分析程序：

注：所有樣品在測試前必須進行預處理（見樣品預處理和儲存第節）。不要對校準器和試劑盒控件進行預處理，因為它們是現成的。所有試劑和樣品在使用前必須達到室溫。校準器、控制裝置和樣品應一式兩份進行化驗。一旦程序開始，所有步驟都應該不間斷地完成。

1. 所有試劑盒組分達到室溫后，輕輕倒置混合。

2. 準備1倍工作HRP結合物和1倍工作洗滌緩沖液。

3. 準備待測的血清樣本（見樣本預處理及儲存部分）。

4. 從微孔板中取出所需數量的條帶，并組裝成板架。將未使用的條帶放回帶有干燥劑的袋子中，重新密封，并存放在冰箱中。

5. 將每個校準品、對照品和預處理樣本的20 μL分別加入指定孔中，并進行復孔操作。

6. 向每個孔中加入200 μL的檢測緩沖液（推薦使用多通道移液器）。

7. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育30分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉/分鐘）。

8. 使用自動微孔板洗滌器（首選）或按以下方法手動洗滌微孔板。

自動：使用1倍工作洗滌緩沖液（每孔300 μL）進行3周期洗滌（3次300 μL）。一個周期包括吸去所有孔中的液體，然后每個孔中注入300 μL的1倍工作洗滌緩沖液。在最后一次洗滌周期后，吸去所有孔中的液體，然后將板子牢固地拍打在吸水紙上以去除殘留液體。

手動：使用1倍工作洗滌緩沖液（每孔300 μL）進行3周期洗滌（3次300 μL）。一個周期包括通過將孔中的內容迅速倒入廢液容器來吸去所有孔中的液體，然后使用多通道移液器向每個孔中注入300 μL的1倍工作洗滌緩沖液。在最后一次洗滌周期后，通過將孔中的內容迅速倒入廢液容器來吸去所有孔中的液體。將板子牢固地拍打在吸水紙上以去除殘留液體。

9. 向每個孔中加入100 μL的1倍工作HRP結合物（推薦使用多通道移液器）。

10. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育15分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉/分鐘）。

11. 按照步驟8中的方法再次洗滌微孔板孔。

12. 向每個孔中加入100 μL的TMB底物（推薦使用多通道移液器）。

13. 在室溫下，放在微孔板搖床上孵育10-15分鐘（往復式搖床約180次/分鐘或軌道式搖床約600轉/分鐘）。

14. 按照加入TMB底物的相同順序和時間間隔，向每個孔中加入50 μL的停止溶液（推薦使用多通道移液器）。輕輕拍打微孔板架以混合孔中的內容。

15. 在加入停止溶液后20分鐘內，使用設定為450 nm的吸光度微孔板讀取器測量光密度（吸光度）。

C-反應蛋白（hsCRP）ELISA典型校準器曲線：

僅示例曲線。不用于計算結果