蛋白質分離純化一條街：part A－凝膠過濾層析（續前篇）

上一篇 / 下一篇 2009-03-24 08:20:11

2）裝柱與平衡
裝柱前須將凝膠上面過多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關閉出口，向柱管內加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開柱的出口，調節合適的流速，使凝膠繼續沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時停止裝柱，關閉出水口。裝柱要求連續、均勻、無氣泡、無“紋路”。將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來在加樣時凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。

3）上樣與洗脫

樣品上柱是實驗成敗的關鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會使區帶擴散，影響層析效果。上樣時應盡量保持床面的穩定。先打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1－2mm時，關閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應避免將床面凝膠沖起，打開出口并開始計算流出體積，當樣品滲入床中接近床表面1mm時關閉出口。按加樣操作，用少量（約1ml）洗脫液沖洗管壁2次。最后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3－5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進水口連通恒流泵，調好流速，以每管3ml/10min流速開始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1-2%；制備用量為柱床容積的20%~30%。

4）收集與鑒定
用自動部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測儀280nm波長處檢測，最高的一個OD值時的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5）凝膠柱的處理
凝膠用過后，反復用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長期用干燥狀態保存。
計算
分子量的測定和計算，一般都采用標準曲線法。只要測得幾種標準蛋白質相對分子質量的Ve，并以它們的相對分子質量的對數(logMr)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對分子質量。
注意事項
各接頭不能漏氣，連續用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內的排氣管應無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內液面不斷下降，則表示整個系統有漏氣之處，應仔細檢查并加以糾正。
始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則水分揮發，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動，導致分離效果變壞，不得不重新裝柱。