蛋白質分離純化一條街：part A－凝膠過濾層析

上一篇 / 下一篇 2009-03-21 20:34:23

蛋白質分離純化一條街：凝膠過濾層析

凝膠過濾層析（Gel Filtration Chromatography，GFC）又稱

尺寸排阻層析（Size Exclusion Chromatography，SEC）

凝膠滲透層析（Gel Permeation Chromatography，GPC）

分子篩層析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）

注：在高效液相色譜分析中，用GFC或SEC表示凝膠過濾色譜或尺寸排阻色譜，流動相通常是水溶液；在有機高分子分析中，常用GPC表示凝膠滲透色譜，流動相通常是有機溶劑；在蛋白質分離純化中用GFC或SEC表示凝膠過濾層析或尺寸排阻層析；本文以下內容均針對蛋白質分離，因此均以凝膠過濾層析（GFC）表示。

（1）分離機理

GFC填料是由高分子交聯而成、內部具有網狀篩孔的固體顆粒，利用球狀凝膠內的篩孔的大小，不同水力學半徑的分子在通過填料時運行路徑存在差異，利用該差異將不同大小的蛋白質進行分離。

蛋白質分子流過填充凝膠的管柱時，大分子無法進入凝膠篩孔，而只流經凝膠及管柱間的孔隙，因此總體運行路徑較短，從層析柱入口到出口所需時間較短；較小的分子因為進入凝膠內的篩孔，總體運行路徑較長，故在管柱內的停留時間較長；基于此原理可以區分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而確定未知樣品的分子量。

注1：球形蛋白與線性分子在凝膠過濾層析中的保留行為存在差異，因此使用球形蛋白制作的分子量標準曲線不能用于明膠多肽、淀粉或其它聚合物。

（2）應用范圍

A 蛋白質分離，基于混合中不同蛋白質分子尺寸大小進行分離；

B 分子量測定，蛋白質分子量（球形）的對數與其在凝膠過濾層析時的保留時間呈線性關系；

C 樣品脫鹽或溶劑置換。

（3）填料要求

一般狀況下，用于制備凝膠過濾層析的填料應不吸附目標成份，所有欲分離物質均被洗脫出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。凝膠的材質需為化學惰性，與分離物不能產生變性（denature）或是其它化學反應，最好具有能長期反復使用的穩定性，并可以在較大的pH和溫度范圍內使用。凝膠要有一定的機械強度，在層析過程中才不會變形，增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行，縮短分離時間。

（4）凝膠過濾常用填料種類

目前常用的凝膠包括3個主要類型：

A：葡聚糖凝膠（Polydextran），商品名稱是Sephadex

Polydextran幾乎不溶于溶劑中，親水性強，能迅速在水和電解質溶液中膨脹，在堿性的環境中十分穩定，所以可以用堿去除凝膠上的污染物。

Sephadex G-X，X表示葡聚糖的交聯程度，數值越大則交聯度越小，但吸水量越高，X值大致是吸水量的10倍。以Sephadex G-25為例，表示1克干燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml。

Sephadex的分離范圍與填料粒經和交聯度密切相關，大概范圍如下：

型號粒度（微米）有效分離范圍（球形蛋白質）

G 10 55－166 <700

G 15 60-180 <1500

G 25 - 1000-5000

G 50 - 1500-30000

G 75 - 3000-80000

G 100 - 4000-150000

G 150 - 5000-300000

G 200 - 5000-600000

Superdex屬于葡聚糖以共價結合到交聯多孔瓊脂糖珠體上的球形凝膠，流速快、反壓低。

型號粒度（微米）有效分離范圍（球形蛋白質）

Superdex 30 24-44 <10000

Superdex 75 24-44 3000-70000

Superdex 200 10000-600000

B 聚丙稀酰胺凝膠（Polyacrylamide）

Polyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，干粉顆粒狀。依膠的分離范圍不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑，但它在極端的pH下會被水解，水解后產生的COOH-具有離子交換的性質，因此pH 值應盡量控制在2-10之間。

型號粒度（微米）有效分離范圍（球形蛋白質）

Bio-Gel P-2 - <1800

Bio-Gel P-4 - 800-4000

Bio-Gel P-6 - 1000-6000

Bio-Gel P-10 - 1500-20000

Bio-Gel P-30 - 2500-40000

Bio-Gel P-60 - 3000-60000

C 瓊脂糖凝膠

商品名稱Sepharose，由屬于天然凝膠，依凝膠中干膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質，因其顆粒軟，在分離過程有時會阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會融化，故需于較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads后不能再脫水干燥，所以要在濕態中保存。

經2，3－二溴丙醇反應交聯而成的凝膠為Sepharose CL型凝膠

型號粒度（微米）有效分離范圍（球形蛋白質）

Sepharose 2B 70000－40000000

Sepharose 4B 60000－20000000

Sepharose 6B 10000－4000000

Sepharose CL-2B 70000－40000000

Sepharose CL-4B 60000－20000000

Sepharose CL-6B 10000－4000000

Superpose 瓊脂糖經多次交聯形成的凝膠。

型號粒度（微米）有效分離范圍（球形蛋白質）

Superose 6 5000－5000000

Superose 12 1000－300000

其它凝膠：聚丙稀酰胺葡聚糖凝膠，交聯聚苯乙烯凝膠，聚乙烯醇凝膠等，還有更多新型號的凝膠。

4 操作實例（轉載）

1）凝膠溶脹

凝膠顆粒要求大小比較均勻，可流速穩定，結果較好。取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時間因凝膠交聯度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時，這樣可大大縮短溶脹時間，而且可以殺死細菌和霉菌，并可排出凝膠內氣泡。溶脹過程中注意不要過分攪拌，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細小顆粒，最后凝膠經減壓抽氣除去氣泡，即可準備裝柱。