高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量

高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量?

作者：曾立明 黃宇丹 唐 銀(湖南醫科大學附屬湘雅醫院檢驗科 410078)?

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　摘要報告了用高效液相色譜法同時測定血清中頭孢哌酮和舒巴坦的含量。本法以外標法為基礎，0.5mL血清標本經甲醇沉淀蛋白，離心后上清液進樣。

?? ?色譜分析條件：以C18反相柱作分析柱，流動相組成為0.005m mol/L四丁基氫氧化銨—乙腈(825∶175，V/V)，磷酸調整pH至5.0，流速為1.0mL/min，在紫外檢測器230nm進行檢測。本法的頭孢哌酮和舒巴坦的最低檢出濃度分別為10mg/L和5mg/L，至少在10～1000mg/L范圍內呈線性，頭孢哌酮和舒巴坦的絕對回收率分別是99.4％～102.9％和95.0％～105.3％，批內和批間RSD分別是1.4％、1.5％和1.8％、1.9％。對10種臨床常用的β-內酰胺類藥物進行了干擾實驗，未發現有干擾峰。

?? ?β-內酰胺酶的產生已迅速波及到許多種類的細菌并且已經成為影響β-內酰胺類抗生素的主要威脅［1，2］，以至許多頭孢菌素對產β-內酰胺酶的細菌并不具有“深譜”抗菌能力，舒普深(Sulperazon)內含舒巴坦鈉和頭孢哌

酮鈉；由于舒巴坦(Sulbactam)是一種強有力的β-內酰胺酶抑制劑，而頭孢哌酮(Cefoperazone)是第三代頭孢菌素類抗生素，具有廣譜的抗菌作用，兩者聯合具有明顯的協同作用，是一種全新的廣譜加上深譜的頭孢菌素類抗生素，在臨床治療中廣泛使用。但如果用藥不當會產生副作用或未達到合理用藥的目的。因此，測定血液中該藥物的濃度，對于研究不同疾病條件下該藥物的作用機理、藥代動力學以及制定合理的給藥方案十分必要［3］。

?? ?用高效液相色譜法測定舒巴坦和頭孢哌酮的方法已有很多報道，但絕大多數方法是在一個色譜條件下測定一種藥物，為此，筆者建立了一種能同時測定血清頭孢哌酮和舒巴坦含量的高效液相色譜法。該法在保證足夠的靈敏度、精密度和準確度的前提下，達到操作簡便、節約有機溶劑、節省人力和時間的目的。

?? ?以外標法為基礎，血清樣品經甲醇沉淀蛋白，取上清液過濾，濾液直接進樣，用C18反相柱進行色譜分析，紫外檢測器在230nm波長下進行檢測，以峰面積定量。

　抽取血液放入普通玻璃試管中(勿溶血)，分離血清后立即測定，如不能立即測定應將血清密封，置4℃冰箱或-20℃下保存，一周內測定。

　高效液相色譜儀：包括Waters 510泵，486紫外可見光檢測器，U6K進樣閥，PC800色譜工作站，AST486微機。平頭微量注射器：Hamilton 25μL，美國。樣品過濾器：New Hyde Park，日本。樣品過濾膜：Millipore 0.5μm，美國。離心沉淀機：LXJ—Ⅱ型，南京第一醫療器械廠生產。

　標準物：頭孢哌酮(純度為93.8％)和舒巴坦(純度為99.5％)均由中國大連輝瑞制藥有限公司提供。溶劑：四丁基氫氧化銨和磷酸為國產分析純試劑；乙腈和甲醇為國產色譜試劑；水為Millipore超純水器生產。

標準液：室溫下分別配制濃度為1g/L的頭孢哌酮和舒巴坦的甲醇溶液，密封。置4℃冰箱保存，用前取出放至室溫后使用。

血清標準應用液：參考舒普深血清藥代動力學資料［4］，確定兩藥物標準曲線各點的血清藥物濃度(表1)。用健康正常人無藥混合血清配制。將不同濃度的血清標準應用液分裝，密封，置-20℃保存，至少在二周內是穩定的。

	頭孢哌酮	舒巴坦
血清標準應用液Ⅰ	10	5
Ⅱ	50	20
Ⅲ	100	50
Ⅳ	200	100
Ⅴ	400	200
Ⅵ	500	500
舒普深2g血清峰［4］	259.4	95.6

　流動相：四丁基氫氧化銨溶液(0.005m mol/L，磷酸調pH至5.0)和乙腈按825∶175(V/V)比例混合，混勻后用超聲波脫氣15min。

　取所需數目的6mL圓底帶塞試管，于試管中分別加入標準血清應用液、空白無藥血清和病人標本各0.5mL。于各管中準確加入甲醇0.5mL，旋渦1min，離心(3000r/min)15min。吸取上清液過濾，取濾液20μL進樣。

　分析柱：Nova-PakR○C18 ?4μm，3.9mm×150mm，檢測波長：UV230nm，流速：1.0mL/min。柱溫：室溫。

　在PC800色譜工作站中設置好各有關參數，得出頭孢哌酮和舒巴坦的血清標準物的峰面積。以各藥標準血清的峰面積為縱坐標，其相應的血藥濃度為橫坐標，分別繪制各藥的標準曲線。由待測標本的峰面積，在標準曲線上查出其相應的血藥濃度。亦可根據各藥的峰面積與血藥濃度的回歸方程，計算標本的血藥濃度。

　空白無藥血清無內源物干擾，兩藥物均達到基線分離，頭孢哌酮和舒巴坦的出峰時間分別是3.62和7.11min，色譜分析過程在10min內完成。色譜圖見圖1～4。

圖1 空白血清色譜圖

圖2 甲醇混合標準液色譜圖

A.堿性降解產物 B.頭孢哌酮(500mg/L)C.舒巴坦(500mg/L)

圖3 血清標準液色譜圖

A.頭孢哌酮(300mg/L) B.舒巴坦(200mg/L)

　在上述實驗條件下各藥的血藥濃度(X)與峰面積(Y)的線性關系良好，頭孢哌酮和舒巴坦的直線回歸方程分別是：

Y＝835X+8750 ?r＝0.9996

Y＝1873.9X-6217.3 ?r＝0.9999

各被測藥物自檢出限至少至1000mg/L范圍內呈線性關系。

圖4 病人血清標本色譜圖A.頭孢哌酮(205mg/L) B.舒巴坦(166mg/L)

　以引起兩倍于噪音的藥量為最低檢出量，以經預處理后的進樣藥量等于最低檢出量的標本藥物濃度為最低檢出濃度。本法的最低檢出濃度分別是：頭孢哌酮為10mg/L，舒巴坦為5mg/L。

? 用下列公式計算絕對回收率，結果見表2。

絕對回收率＝

(經甲醇處理后上清液藥物峰面積)/(相應濃度標準液直接進樣后的峰面積)

×(1)/(0.5)×100％

血藥濃度(mg/L)	頭孢哌酮	舒巴坦
20	—	102.1
50	100.5	95.0
100	100.2	100.8
200	100.1	102.3
400	102.9	—
500	99.4	105.3

3.5　精密度

　各自選擇5個水平的血藥濃度作批內變異，1個水平的血藥濃度作批間變異，結果如表3。

　在上述色譜條件下，對10種臨床常用的β-內酰胺類藥物(氨芐青霉素、羥氨芐青霉素、青霉素G鈉鹽、氧哌嗪青霉素、克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢呋辛進行了干擾實驗，均未發現有干擾峰。

4.1　色譜體系的選擇　在分析堿性藥物時，多采用反相柱，它可使血液中的內源性強極性成分快速洗脫下來，避免對測定藥物的干擾，同時也縮短了測定時間，筆者采用了C18反相柱進行分離。固定相確定以后，流動相的組分對被測物的色譜分離起著決定性的作用，筆者曾試用甲醇(多種比例)作為流動相中的強溶劑和采用文獻［5～7］所用流動相，分離度和峰形均不令人滿意，改用乙腈作為強溶劑和用四丁基氫氧化銨作為添加劑，且按照一定比例配制及調整pH，就獲得了滿意的分離度。

4.2　樣品的預處理　本法樣品處理操作簡單、快速，試劑易得，基本上能滿足臨床檢測的要求，如需提高檢測靈敏度，還需要將提取液進一步濃縮和重組，然后再進樣分析，此有待進一步摸索改進。

4.3方法概述和應用實例　采用本實驗所設計的流動相能將舒普深中頭孢哌酮和舒巴坦完全分離，雖然舒巴坦中常含有堿性降解物，但它并不干擾本法含量測定(見圖2)；分離后雖然用外標法以峰面積計算出組分的含量。但由于樣品處理過程簡單，人為影響因素少，且通過多次實驗證明本法的特異性強，靈敏度較高，重現性和回收率結果良好，與文獻報道［5，7］舒巴坦和頭孢哌酮分別測定所得的線性、重現性和回收率相比該法要稍優，雖靈敏度稍差，但各組分的測定結果均能滿足臨床應用的要求。另外，通過比較，無論是用峰面積或是峰高計算結果，均無明顯差別。本方法建立以后，已對臨床90多人次燒傷病人用藥后的血清標本進行了測定，未發現內源性物質和藥物的代謝產物的干擾，說明本法能夠滿足對舒普深臨床血藥濃度和藥代動力學監測的要求。

1 Acar J F.Problems and changing patterns of resistance with gram-negative bacteria.Rev Infect Dis,1985,7(suppl 4)S:545

2 Acar J F,et al.Role of β-lactamases in the resistance of gram-negative bacilli to β-lactam antibiotics.Rev Infect Dis,1986,8(suppl 5):S482

3 吳萊文主編.治療藥物監測.人民衛生出版社，1989.2

4 Saito A.Absorption,excretion,distribution and metabolism of sulbactam/cefoperazone,in Ueda Y,Neu H C.β-lactamase blocking agents.Tokyo:University of Tokyo Press,1986.51

5 劉金芳等.氨砜西林注射液中氨芐西林和舒巴坦的HPLC測定.中國醫藥工業雜志，1994，25(4)：172

6 Mohammad A,et al.Measurement of anoxicllin and clavulanic for injection by high-performance liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal,1991,9(9):731

7 商 ?澎等.血清和組織間液中頭孢哌酮的高效液相色譜測定方法.藥物分析雜志，1992，12(6)：327

Zeng Liming,Huang Yudan and Tangyin

(Xiangya Hospital,Hunan Medical University,410078)

Simultaneous determination of the content of cefoperazone and sulbactam in serum by HPLC is reported.On the basis of external standard method,the protein of 0.5mL serum sample was precipitated by methanol,and the supernatant was injected into HPLC after centrifugation.The analytical column was a C18 reversed-phase column, the mobile phase consisted of tetrabutylammonium hydroxide(0.005m mol/L) and acetonitrile(825∶175，V/V)，pH was adjusted to 5.0 with phosphoric acid.The flow rate was 1.0mL/min，and the detection was carried out with an ultraviolet detector (λ＝230nm).The detection limits of cefoperazone and sulbactam were respectively 10mg/L and 5mg/L.The linearity was in the range of 10～1000mg/L.The absolute recovery of cefoperazone and sulbactam was respectively 99.4％～102.9％ and 95.0％～105.3％.

The between-day RSD of cefoperazone and sulbactam was 1.4％ and 1.5％,and intra-day RSD was 1.8％ and 1.9％ respectively.We did not find any interference peak from ten commonly used β-lactam drugs.

Key words: cephalosporin sort antibiotics,β-lactamase inhibitor,HPLC