緩沖鹽、離子對和有機改性劑對反相高效液相色譜保留的影響機理

使用化學鍵合有機固定相的反相高效液相色譜已成為液相色譜中最重要的方法，在所有要進行分離分析的化合物中，有三分之二可用之來完成。反相液相色譜最初是用來分離非極性和非離子型化合物的。隨著研究的不斷深入，實踐證明，將流動相的組分進行調節，往水溶性流動相中加入適當的緩沖液或有機改性劑，即控制流動相的二次化學平衡，能使大多數極性和離子性化合物在反相色譜中獲得成功的分離；除對保留和選擇性進行控制外，還可靠抑制干擾競爭平衡或副反應來改善峰形。
一、緩沖液的使用及離子抑制
大量實驗結果證實，對弱酸、弱堿這些在水溶性溶液中易發生離子化的樣品進行分離時，最簡便的方法就是用緩沖液來調節流動相的pH值,亦即對離子化過程進行抑制，所以此方法被稱為“離子抑制”(lon Suppress)，且離子抑制最有效范圍是在pH3—8。由于ODS柱的化學不穩定性，在pH1.5—8范圍之外，固定相會發生降解，所以對pKa小于2或大于7的化合物就不適宜用緩沖液來抑制離子化。但近年來HPLC迅速發展，使用化學性質更為惰性的大孔聚合物（苯乙烯—二乙烯苯）固定相，使得流動相使用的PH范圍達到1—13,因而離子選擇性的優點也可用于強酸和強堿的分離。 關于離子抑制的機理還未確切了解，目前認為有兩個主要原因，第一，認為流動相中的緩沖液與被分析樣品相互反應，使得樣品的離子平衡向“中性”形式移動，這就易于在反相柱上進行色譜分配。當PH值低于某弱酸的PKa時，則其保留時間就長（抑制了離子化），反之，當pH值高于PKa時，洗脫就快；堿性樣品正好相反。PH值高于PKa，保留時間則長，PH值低于pKa，洗脫就快。之所以樣品的離子形式比中性形式洗脫較快是因為離子形式更易溶于水溶性流動相。上述機理是離子化的控制。
第二種解釋是緩沖調節劑使得表面殘留硅醇基與樣品的相互作用減到最小，這是因為緩沖調節劑能“復蓋”這些硅醇基團，阻止其吸附樣品分子和參與離子樣品的保留。尤其是磷酸鹽緩沖液，其作用機理可能就屬于后者。
二、離子對色譜
離子對技術在很多情況下可代替離子交換用于分離離子化合物。此方法現已能夠對大量化合物（包括生物胺、藥物及其代謝物、染料、羧酸等）進行有效分離。現代離子對液體色譜可歸為幾類：
1．正相離子對分配色譜，將會有離子對試劑的水溶液涂布在硅膠上，用有機溶劑流動相洗脫化合物；
2．反相離子對分配色譜，固定相為非極性表面（如C8或C18），分離酸時在水溶性流動相中加入有機堿（如磷酸四丁銨），分離堿時可加入有機酸（如辛基磺酸）。因為用離子交換法分離中性和離子樣品時并非都令人滿意，而用離子抑制法分離離子化合物也有困難，所以反相離子對色譜已廣泛用于分離帶不同電荷的化合物。離子對色譜的保留機理一直難以確定。目前有三種假設，其中的兩種提出了較極端的情形，而且各自都包羅了數量可觀的色譜數據，它們分別是離子對模式和動力學離子交換模式，第三種觀點則是離子相互作用機理。
離子對機理強調，被分離化合物與流動相中的相反離子形成離子對，然后這一不帶電荷的離子對分配進入親脂性固定相中，經理論推導認為，被分離化合物的保留是由離子對的結合力及相反離子的濃度決定的。離子對越易溶于親脂性固定相，流動相中相反離子濃度越高，則保留時間越長。然而有些實驗結果都表明，對于某些相反離子，超過一定濃度，則保留時間反而會減小。
離子交換機理，是假設不成對的相反離子吸附在非極性固定相表面，其離子基團在表面定向排列，使柱子產生離子交換柱的效果。離子對試劑的鏈越長，則在“離子交換器”的表面復蓋得越多，因而保留時間也越長。
Bidlingmeyer等提出了離子相互作用機理。他們在實驗中將一系列中性和帶電荷的樣品注射到含有帶正、負電荷親脂化合物的流動相系統中去，無論是離子對還是離子交換機理都不能圓滿地解釋所得到的結果，而用離子相互作用機理來解釋也許更為恰當。此機理無須假設在任何一相形成離子對，而是認為由于親脂離子的動力學平衡導致表面形成了電子雙電層，樣品的保留是由自由離子對試劑提供的表面電荷強度所產生的靜電力以及對非極性表面的附加吸附作用產生。關于離子對現象確切機理的爭論還在繼續，由于離子對方法被證實對極性化合物有很好的選擇性，所以對藥物及其在生物體系中常遇到的一些化合物的分析極為有用，尤其在氨基酸、核酸、肽及蛋白質的分析方面是很有潛力的。
三、有機胺類調節劑
大量色譜實踐證實，在用鍵合反相色譜分離各種疏水銨、含氮化合物、肽、蛋白質及各種堿性物質時，常有拖尾現象發生，峰形不對稱，而往流動相中加入烷基胺或其他銨類化合物時，就能使峰形大為改觀。Horvath及其同事們，首先提出了反相鍵合固定相上的雙保留機理。他們認為，樣品的保留并不象有些作者認為那樣僅僅是憎溶作用，而且還存在著被測物與固定相表面上的殘留硅烷醇基之間的相互作用，尤其是在含水較少的水一有機溶劑流動相中，硅烷醇基更易與樣品發生反應，在流動相中加入胺類或銨類化合物，其作用是將硅醇基掩蓋，使其不能與樣品發生作用。這些加入的堿往往被稱之為競爭（competitive）堿，因為它們與樣品的堿性基團發生競爭，吸附在硅醇基上。值得注意的是，所加入的競爭堿中有一定的濃度范圍，低于或超過此范圍峰形都得不到改善，這說明殘留硅烷醇基的吸附能力是有限的。