細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒化驗程序說明

細胞核和細胞質蛋白質的提取不僅可以用于研究細胞內蛋白質的定位，而且在許多情況下也是如此。提取蛋白可用于轉錄調控的研究，如Western印跡、電泳遷移率轉移測定（EMSA）、足跡分析、轉錄測定，或作為純化調控蛋白的起點。細胞核和細胞質蛋白提取試劑盒能夠從哺乳動物培養的細胞或組織中逐步分離和制備粗細胞質和細胞核提取物。該試劑盒的基礎是允許細胞在低滲緩沖液中膨脹。然后細胞被破壞，細胞質部分被去除，核蛋白通過高鹽緩沖液從細胞核中釋放出來。未變性的活性蛋白質在不到兩小時的時間內被純化

艾美捷細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒：

Cat #: D-AKE3001

Size: 50T

Storage: Stored at -20°C for 12 months

供應材料和儲存條件：

試劑準備

工作細胞質溶液A（工作CESA）：使用前，將10μL蛋白酶抑制劑（100×）和2μL DTT（500×）加入1mL CESA中，置于冰上，在4℃下儲存。

細胞質溶液B（CESB）：供應即用。使用前放在冰上，4℃保存。

工作核提取溶液（工作NES）：使用前，將10μL蛋白酶抑制劑（100×）和2μL DTT（500×）添加到1 mL NES中，置于冰上，在4°C下儲存。

DTT（500×）：隨附隨用。使用前放在冰上；儲存溫度為-20°C。剩余的工作解決方案可以是

等分后保存于-20℃，避免重復凍融。

蛋白酶抑制劑（100×）：隨附即用。使用前放在冰上；儲存在-20°C。剩余工作

溶液等分后可在-20°C下儲存，以避免重復冷凍和解凍。

細胞核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒化驗程序：

注：在2-8°C溫度下執行所有步驟。使用預冷緩沖器和設備。確保所有溶液均已解凍且均勻。

I-A細胞培養制劑

1.對于粘附細胞，收獲2×10? 用細胞刮刀對細胞進行刮除，然后在500 g離心5分鐘。對于懸浮細胞，通過在500 g下離心5分鐘來收獲。

2.通過用冷PBS懸浮細胞顆粒來洗滌細胞。以500g離心2-3分鐘，并丟棄PBS。

注意：使用移液管小心取出并丟棄PBS，使細胞顆粒盡可能干燥。

3.向細胞沉淀中加入200μl冷加工CESA。進行程序Ⅲ。

1-B組織制備

1.將30-60毫克的組織切成小塊，放入離心管中。

2.用PBS清洗紙巾。將組織以500g離心5分鐘，并丟棄PBS。

注意：使用移液管小心取出并丟棄PBS，使樣品盡可能干燥。

3.將組織在200μl冷的CESA中輕輕復蘇。

4.使用Dounce勻漿器勻漿組織，直到90%以上的細胞破碎，并在顯微鏡下觀察細胞核。繼續步驟III。

ll細胞質和細胞核蛋白質提取：

1.在最高設置下劇烈渦旋試管15 s，以完全懸浮細胞顆粒。將試管在冰上培養15分鐘，使細胞膨脹。

2.向試管中加入10μL冷的CESB。在最高設置下使管子渦旋10-15秒。將試管在冰上培養1-2

最小。

3.將試管在4℃下以16000 g離心5分鐘。

4.立即將上清液（細胞質提取物）轉移到干凈的冷管中。將此試管放置在冰上直到使用，或在-80°C下保存更長時間。顆粒（含有核）通常是粘性的，并且不是很緊密。

可選：為了去除細胞核中殘留的細胞質蛋白，用額外的coldWorking CESA緩沖液或PBS沖洗顆粒。然后重復步驟3和4中的步驟lll 1-2次。

5.加入100μL預冷的工作NES，重新懸浮顆粒。將樣品放在冰上，每10分鐘繼續渦旋15秒，持續30分鐘。避免形成泡沫。

6.在4℃下以16000 g離心15分鐘。

7.將上清液（核蛋白）加入冷離心管中，取出小份進行蛋白質定量檢測。將其他含有核蛋白的離心管儲存在-80°C。避免反復結冰和滑行。

注：根據方案提取的核蛋白懸浮在高鹽緩沖液NES中。如果在隨后的應用中需要大量的核提取物，或者如果下游分析出現問題，則在使用前對核提取物進行透析以去除多余的鹽。

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