植物
代謝組學的研究方法及其應用0 近年來，隨著生命
科學研究的發展，尤其是在完成擬南芥 （Arabidopsis thaliana） 和水稻 （Oryza sativa） 等植物的
基因組測序后，植物
生物學發生了翻天覆地的變化。人們已經把目光從基因的測序轉移到了基因的功能研究。在研究 DNA 的基因組學、mRNA 的轉錄組學及
蛋白質的蛋白組學后，接踵而來的是研究代謝物的代謝組學 （Hall et al.，2002）。代謝組學的概念來源于代謝組，代謝組是指某一生物或
細胞在一特定生理時期內所有的低分子量代謝產物，代謝組學則是對某一生物或細胞在一特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量
分析的一門新學科 （Goodacre，2004）。它是以組群指標分析為基礎，以高通量
檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標的系統生物學的一個分支。
代謝物是細胞調控過程的終產物，它們的種類和數量變化被視為生物系統對基因或
環境變化的最終響應 （Fiehn，2002）。植物內源代謝物對植物的生長發育有重要作用 （Pichersky and Gang，2000）。植物中代謝物超過20萬種，有維持植物生命活動和生長發育所必需的初生代謝物；還有利用初生代謝物生成的與植物抗病和抗逆關系密切的次生代謝物，所以對植物代謝物進行分析是十分必要的。
但是，由于植物代謝物在時間和空間都具有高度的動態性 （stitt and Fernie，2003）。尤其是次生代謝物種類繁多、結構迥異，且產生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發育時期的特異性，難于進行
分離分析，所以人們一直在尋找更為強大的檢測分析工具。在代謝物分析領域，人們已經提出了目標分析、代謝產物指紋分析、代謝產物輪廓分析和代謝表型分析、代謝組學分析等概念。20世紀90年代初，Sauter 等（1991）首先將代謝組分析引入植物系統診斷，此后關于植物代謝組學的研究逐年增多。隨著擬南芥等植物的基因組測序完成以及代謝物分析手段的改進和提高，今后幾年進入此研究領域的科學家和研究機構將越來越多。
1 研究方法 代謝組學分析流程包括樣品制備、代謝物成分分析鑒定和數據分析與解釋。由于植物中代謝物的種類繁多，而目前可用的成分檢測和數據分析方法又多種多樣，所以根據研究對象不同，采用的樣品制備、分離鑒定手段及數據分析方法各不相同。
1.1 樣品制備 植物代謝物樣品制備分為組織取樣、勻漿、抽提、保存和樣品預處理等步驟 （Weckwerth and Fiehn，2002）。代謝產物通常用水或有機溶劑（如甲醇和己烷等）分別提取，獲得水提取物和有機溶劑提取物，從而把非極性的親脂相和極性相分開。分析之前，通常先用固相微萃取、固相萃取和親和
色譜等方法進行預處理 （邱德有和黃璐琦，2004）。然而植物代謝物千差萬別，其中很多物質稍受干擾結構就會發生改變，且對其分析鑒定所采用的設備也不同。目前還沒有適合所有代謝物的抽提方法，通常只能根據所要分析的代謝物特性及使用的鑒定手段選擇合適的提取方法。而抽提時間、溫度、溶劑成分和質量及實驗者的技巧等諸多因素也將影響樣品制備的水平。
1.2 成分分析鑒定 對獲得的樣品中所有代謝物進行分析鑒定是代謝組學研究的關鍵步驟，也是最困難和多變的步驟。與原有的各種組學
技術只分析特定類型的物質不同，代謝組學分析對象的大小、數量、官能團、揮發性、帶電性、電遷移率、極性以及其他物理
化學參數差異很大，要對它們進行無偏向的全面分析，單一的分離分析手段往往難以保證。色譜、
質譜、核磁共振、
紅外光譜、庫侖分析、紫外吸收、熒光散射、發射性檢測和光散射等分離分析手段及其組合都被
應用于代謝組學的研究 （許國旰和楊軍，2003），一般根據樣品的特性和實驗目的，可選擇最合適的分析方法。目前最常用的分離分析手段是
氣相色譜和質譜聯用 （GC/MS）、
液相色譜和質譜聯用 （LC/MS）、核磁共振 （NMR） 以及傅里葉變換紅外光譜與質譜聯用 （FTIR/MS）。
1.2.1 氣相色譜和質譜聯用，液相色譜和質譜聯用 色譜是最常用和有效的分離分析工具，其與質譜的聯用則可以完成從成分分離到鑒定的一整套工作。GC/MS 和 LC/MS 可以同時檢測出數百種化合物，包括糖類、有機酸、
氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代謝物 （Taylor et al.，2002；Tolstikov and Fiehn，2002）。GC/MS有很好的分離效率且相對較為經濟，但需要對樣品進行衍生化預處理，這一步驟會耗費額外的時間，甚至引起樣品的變化。受此限制。GC/MS 無法分析膜脂等熱不穩定性的物質和分子量較大的代謝產物。Roessner 等（2000，2001a，2001b）利用 GC/MS 對馬鈴薯 （Solanum tuberosum 'Desiree'） 進行高通量代謝物分析，同時檢測到150種化合物，其中77種被鑒定為氨基酸、有機酸或糖。利用 GC/MS 進行代謝組學研究的代表性工作是 Fiehn 等（2000） 的一系列有關植物代謝的研究。他們用 GC/MS 對模式植物擬南芥的葉子提取物進行了研究，定量分析了326個化合物，并確定了其中部分化合物的結構。
LC/MS 中目前應用較廣的是高效液相色譜和質譜聯用 （HPLC/Ms）。HPLC 與 GC 原理相似，但在進樣前不需進行衍生化處理，適合那些不穩定、不易衍生化、不易揮發和分子量較大的化合物。HPLC/MS 選擇性和靈敏度都較好，但分析的時間相對較長，且需依賴純的參照物。Fiehn （2003）利用 HPLC/MS 檢測筍瓜 （Cucurbita maxima 'Gelber Zentner'）葉柄和葉片抽提物，檢測到了超過400種代謝物，有90種被定性，其中大部分是氦基酸、糖和糖苷。Huhman 和 Sumner （2002）在紫花苜蓿 （Medicago sativa，Polish Variety Kleszczewska） 和蒺藜狀苜蓿 （Medicago truncatula） 中各鑒定出15個和27個皂角甙，并在紫花苜蓿中找到了2個新的乙二酸皂角甙。
最近，由 LC/MS 發展而來的毛細管電泳質譜聯用技術 （CE/MS） 也被應用到代謝組學研究中。CE/MS 分離樣品效率比普通的色譜質譜聯用要高得多，更為便利的是其耗時很短，往往在10分鐘內就能完成一個樣品的分析過程。Tolstikov 等（2003）用 CE/Ms 對擬南芥進行代謝組分析，分離效果遠遠超過了 Fiehn 等用 GC/MS 進行的先期工作，檢測到超過700個不同的色譜峰值，其中包括許多以前未檢測到的脂類化合物及次生代謝物。
色譜質譜連用技術是目前植物代謝組學研究中應用最多的方法，它具有分離效率高、靈敏度好及經濟實用等優點。但需要解決的主要問題是：大量色譜峰的識別問題以及方法的重現性問題。
1.2.2 核磁共振 在代謝組學領域，核磁共振最初被用于病理生理學和藥理毒理學方面 （Nicholson et al.，1999），但目前也已被廣泛用于植物代謝組學研究 （Blingly and Douce,2001），其優點是非常明顯的。首先，不同于質譜具有離子化程度和基質干擾等問題，NMR 沒有偏向性，對所有化合物的靈敏度是一樣的。其次，NMR 無損傷性，不破壞樣品的結構和性質，可在接近生理條件下進行實驗，可在一定的溫度和緩沖液范圍內選擇實驗條件，可以進行實時和動態的檢測。此外，NMR 氫譜的譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對應的，所測樣品中的每一個氫原子在圖譜中都有其相關的譜峰，圖譜中信號的相對強弱反映樣品中各組分的相對
含量，更為直觀 （顏賢忠 等，2004）。因此，NMR 方法很適合研究代謝產物中的復雜成分。Ward 等（2003）用 1H-NMR 對多種不同生態型的擬南芥進行了代謝組分析，在碳水化合物和脂肪族物質中都發現了差異，說明了植物代謝物和生態型差異的相關性。HyungKyoon 等（2004）用 1H-NMR 對野生型和過表達水楊酸合成基因的轉基因煙草 （Nicotiana tabacum） 的葉片和葉脈進行了研究，通過進行 TMV 嫁接和對照實驗，得到多個峰值變化，大部分峰被鑒定為氯原酸、蘋果酸和糖。此實驗提供了一種有效的不需過多步預處理程序的區分野生型和轉基因植物的方法。當然 NMRt 也有其缺點，與 GC/MS 和 LC/MS 相比， NMR 的缺點是靈敏度低，有可能形成信號重疊，且其對樣品制備的要求很高。同時因為動態范圍有限，很難同時
測定生物體系中共存的濃度相差較大的代謝產物。
1.2.3 傅里葉變換紅外光譜質譜聯用 FTIR/MS 聯用最近也被應用于植物代謝組學分析。FTIR 主要測定樣品中各成分的功能基團和高極性鍵的振動，而特定的化學結構有特定的吸收頻率，通過測定實驗樣品的紅外吸收頻率和強度，可以辨別出各個成分。FTIR 具有掃描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪比及測定光譜范圍寬的特點；缺點在于不可區分異構物，且組分片段和一些絡合離子也對其有影響，由于離子抑制不能進行定量分析。Aharoni 等（2002）利用高分辨率的 FTIR/MS 聯用儀器對鳳梨草莓 （Fragaria ananassa） 組織進行了分析，依據不同的質荷比找到了5844個不同質量的物質，并根據對化合物中高含量的元素的精確質量測定估計了其中一半以上物質的化學結構式。結果表明，在草莓的不同組織中都含有多種類的初生代謝物（如氨基酸、脂肪酸和碳水化合物）及次生代謝物（如類黃酮和萜類化合物）。
1.3 數據分析與解釋 樣品成分分析鑒定之后，需要對所獲得的數據進行相應的整合處理，這也是代謝組學研究中十分關鍵的步驟。應用高通量的檢測分析工具可以得到海量的數據，如果不對其進行合理的處理，這些紛擾的數據反而對研究工作是有害無利的。可應用模式識別和多維統計分析等方法從這些大量的數據中獲得有用的信息，這些方法能夠為數據降維，使它們更易于可視化和分類。目前數據分析常用的兩類算法是基于尋找模式的非監督方法 （unsupervised method） 和有監督方法 （supervised method）。
1.3.1 非監督方法 非監督方法是用來探索完全未知的數據特征的方法，對原始數據信息依據樣本特性進行歸類，把具有相似特征的目標數據歸在同源的類里，并采用相應的可視化技術直觀地表達出來。應用在此領域的常見方法有聚類分析 （cluster analysis） 和主成分分析 （principal components analysis，PCA） 等。
聚類分析依據物以類聚的原理分析具有相似性的事物，將分類對象置于一個多維空間中，根據事物彼此不同的屬性進行辨認，將性質相近的歸入一類，這樣歸在同一類的事物具有高度的相似性；聚類分析就是把事物按其相似程度進行分類，并找出每一類事物共同特征的分析工具。具體到代謝組學中，被歸入一類的物質有相同的特征，可能有相同的功能作用，這樣通過同一類事物中一個研究較為清晰的物質可以推斷該類中其他物質的功能作用。聚類分析過程通常可分為以下步驟：數據收集并且收集相應的變量；產生一個相似矩陣；決定把目標總體細分為幾類，及其對每一種類別相應的定義；實施聚類分析，產生結果。
主成分分析是目前應用最為廣泛的多維分析方法之一。PCA 的特點是將分散在一組變量上的信息集中到某幾個綜合指標，即主成分 （principal component，PC） 上，利用這些主成分來描述數據集內部結構，實際上也起著數據降維的作用。主成分是由原始變量按一定的權重經線性組合而成的新變量。這些變量具有以下性質：1）每一個 PC 之間都是正交的；2）第1個 PC 包含了數據集的絕大部分方差，第2個次之，依此類推。這樣，由頭2個或3個 PC 作圖，就能夠很好地代表數據集所包含的生物化學變化 （Sumnera et al.，2003）。
1.3.2 有監督方法 如果存在一些有關數據的先驗消息和假設，有監督方法比非監督方法更適合且更有效。有監督方法在已有知識的基礎上建立信息組 （class information），并利用所建立的組對未知數據進行辨識、歸類和預測。在這類方法中，由于建立模型時有可供學習利用的訓練樣本，所以稱為有監督學習。應用于該領域的常見方法有線性判別分析 （linear discrimination analysis）、偏最小二乘法-顯著性分析 （PLS-discrimination analysis） 和人工神經元網絡 （artificial neural networks，ANN） （Lindon et al.，2001）。
1.3.3 網上數據庫 在信息時代，利用網絡資源進行研究是必不可少的。而對千頭萬緒的植物代謝物研究，建立相應的網上數據庫也是勢在必行的。這些數據庫的建立也有利于聯結代謝組學與其他系統生物學分支的關系（Oliver et al.，2002；Ge et al.，2003）。目前，最為成熟的數據庫是關于模式植物擬南芥的The Arabidopsis Information Resource（TAIR） （Rhee et al.，2003），http://www.arabidopsis.org。其他常用的網上植物資源有 http://www.york.ac.uk/res/garnet/garnet.htm，http://www.maizegdb.org，http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html。此外網上已有一些與代謝和代謝組學有關的數據庫 （Raoul et al.，2004），主要介紹以下幾個。
ArMet （http://www.armet.org） 是一個涵蓋大部分植物代謝組學研究工作的網站，包含了這些工作開展的時間，甚至還有詳細的實驗步驟，并將代謝物信息
標準化，以便于研究者交流。
DOME （關于 OMEs 的數據庫，http://medicago.vbi.vt.edu/dome.html） 有許多關于代謝物的原始數據和分析結果，同時也有對人們感興趣的一些植物物種的分子生物學研究，分析結果用多維統計軟件處理后可用于 OMEs 的瀏覽器 （BROME） 瀏覽。
MetaCyc （http://metacyc.org） 是一個關于代謝物的數據庫，闡述了超過150種生物體中的代謝途徑，包含了從大量的文獻和網上資源中得到的代謝途徑、反應、酶和底物的資料。
MMP （http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme） 對主要代謝途徑及涉及的關鍵酶進行了詳盡的描述。
2 代謝組學在植物中的應用 雖然植物代謝組學目前尚處于萌芽階段，但其應用前景是十分廣闊的 （Maloney，2004）。下面介紹其中的部分應用。
2.1 代謝組分析 應用代謝組學技術可同時對大量代謝物進行定性定量分析，常用來觀察植物在環境條件改變下的代謝物變化；也可用于研究同一植物不同部位或不同時期的代謝物種類與含量變化；也可根據相關聯的代謝物的量的變化，推測相應的代謝途徑和代謝網絡。Fiehn （2003）利用 GC/MS 對筍瓜 （Cucurbita maxima 'Gelber Zentner'） 的葉柄脈管抽提物和葉片抽提物進行了代謝物分析，得到了400多個峰，通過與質譜數據庫比對，對其中一小部分進行了定性，初步判斷為何種物質；比較了葉柄與葉片間代謝物組分的不同。值得注意的是，即使個體中每種代謝物的量變化很大，其各組分間的比值也能一直維持穩定，這說明了植物中的代謝物雖然種類繁多，但都是互相關聯的。植物利用復雜的機制來維持體內主要代謝物相對穩定的水平。對代謝組的分析力求可檢測樣品中每種代謝物，并可監測各種條件變化下代謝物的變化，這是進行功能基因組學研究的基礎。
2.2 代謝途徑的描述 在對某一代謝途徑中所有代謝物進行了系統研究后，下一步工作就是對代謝途徑的描述。在找到該途徑一系列底物、產物、中間體和關鍵酶的基礎上，闡明這條代謝途徑的調節機制和關鍵調節位點。用代謝組學手段可以方便地找到調節位點——因為在該處，底物和關鍵酶的濃度將會發生相反的變化 （Rolleston，1972）。Tiessen 等（2002）用 HPLC 對馬鈴薯塊莖進行了代謝組分析，檢測了淀粉合成途徑中的一系列底物、中間物、酶及產物量的變化，再通過對野生株和含有異源腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 （AGPase） 轉基因株馬鈴薯進行對比研究，提出了淀粉合成途徑中一種新的調節機制——在離開母體情況下，馬鈴薯塊莖中淀粉合成關鍵酶 AGPase 的催化業基 AGPB 會發生可逆的氧化還原反應形成二聚體，使 AGPase 失活，從而抑制淀粉生成。目前，代謝組學應用于此方面的研究報道尚不多見，主要原因是確定代謝途徑比測定代謝物更為困難，往往只能進行間接的定性估計，從一個個點的代謝物到一條完整的代謝途徑還有很長的路要走。
2.3 基因功能研究 代謝產物是基因表達的終產物，基因表達上極微小的變化也可導致代謝物的大幅改變。以前往往通過可見的表型改變來判斷基因表達水平的升降，耗時較長，且有時候基因表達變化無法引起表型改變，而此時植物體中某些代謝產物的含量卻會發生變化。這時，利用代謝組學方法檢測代謝物的變化就可以判斷基因表達水平的變化，從而推斷基因的功能及其對代謝流的影響 （Stitt and Sonnewald，1995；Stitt，1999）。Lytovchenko 等（2002）通過對馬鈴薯葉片大量代謝物，特別是光合作用途徑中的中間體和終產物進行分析，研究了質體葡萄糖磷酸變位酶 （plastidial phosphoglucomutase） 基因在光合作用中對碳流的影響，發現在其表達水平低的情況下，雖然植物表型沒有變化，但是植物組織中的淀粉、糖和有機酸的含量都有一定降低。這說明質體葡萄糖磷酸變位酶基因表達水平的變化對植物的幾條主要代謝途徑都有很大的影響。
2.4 與轉錄組學和蛋白質組學技術整合 轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學是一個、有機的整體，它們都是系統生物學 （system biology） 的重要組成部分。生物信息是按DNA→mRNA→蛋白質→代謝產物方向流動的，將所獲得的這幾者的信息聯系起來，有利于從整體研究生物系統對基因或環境變化的響應，如可判斷代謝物的變化是從哪一個層面開始發生的。Ferrario-Mery 等（2002）整合了關于轉錄、酶活性及代謝物的數據研究煙草中的碳氮代謝相互作用。通過對 NH4 代謝過程中主要代謝物的定量分析，以及先前掌握的關于氮在轉錄層面的知識，分析了谷氨酰胺合成酶 （glutamine synthetase） 在氮代謝過程中的作用，得到結論是代謝物量的變化與轉錄水平無關，而與轉錄后修飾調節有關。有的研究者同時應用了多種組學方法進行研究，也取得了很好的成果。Yamazakia 等（2003）利用 HPLC/PDA/ESI-MS 對紅色和綠色紫蘇 （Perilla frutescens var. crispa） 的葉片和莖稈進行了代謝組分析，檢測到了大約50個峰。對其中與花青素有關的物質進行了定性定量鑒定和對比，然后用 mRNA 差異顯示技術對從兩種紫蘇的葉片中提取到的 mRNA 進行了篩選，找到了一些差異基因。通過對這兩種方法所獲得的數據進行分析，推斷了一些影響紫蘇成色的基因。
3 問題與展望 目前，關于代謝組學的研究工作雖開展得還不多，但是越來越多的研究者正投身于此領域。第1屆植物代謝組學大會于2002年4月在荷蘭舉行，期間成立了國際植物代謝組學委員會 （International Committee Plant Metabolomics，ICPM） 并建立了該委員會的國際官方網站 （http://www.metabolomics.nl），大大促進了全世界此領域研究者的交流。第2屆植物代謝組學大會于2003年在德國柏林的戈爾姆舉行。第3屆植物代謝組學大會于2004年6月在
美國的愛荷華州舉行。這些國際性的會議極大地促進了植物代謝組學的研究。在我國，關于植物代謝組學的研究也正在逐步展開，邱德有和黃璐琦（2004）用基因芯片和代謝組學技術研究丹參品質形成的分子機理，試圖通過轉錄組學和代謝組學研究來揭示丹參品質形成的原因。軍事醫學科學院、
中國科學院植物研究所及中國科學院大連化學物理研究所等單位也正投入到植物代謝組學的研究浪潮中。
但是，在一項新技術的發展道路上，必然會遇到各種各樣的問題。目前代謝組學面臨的主要問題主要有以下幾方面：
1）分離分析工具的偏差和局限性；
2）海量數據中去粗取精的方法；
3）格式紛繁的數據歸一化和數據庫的建立；
4）代謝組學技術和其他組學技術的連用。
植物代謝組學技術可應用在植物學的許多方面，隨著它積累的數據和信息量越來越大，其在植物學各個領域的應用價值也與日俱增。它不僅能對單個代謝物進行全方面的分析，更能幫助人們更好地了解生物體中的代謝途徑、生物體中各種復雜的相互作用及生物系統對環境和基因變化的響應，最終著眼于將植物代謝組學和其他組學技術整合起來，闡述植物從基因到表型的整套復雜系統是如何運行的。相信隨著更有力的成分分析設備的使用，更多種分離分析手段的整合，更強大的數據挖掘和分析工具的出現，更完備的代謝組數據庫的建立，植物代謝組學將在生物、農業、醫藥及環境等研究領域產生深遠的影響。
