摘 要 生物質譜因其高靈敏度、高準確度、快速、易于自動化等特點，在生命科學領域的應用和研究日益廣泛。該文綜述了近年來生物質譜在蛋白質、核酸、糖類、藥物代謝以及微生物檢驗等方面的應用及進展。
? 關鍵詞：生物質譜；電噴霧；基質輔助激光解吸附；串聯質譜
1 概述
生命科學的發展總是與分析技術的進步相關聯，X射線晶體衍射對DNA雙螺旋結構的闡述奠定了現代分子生物學的基礎，使人類對微觀領域的認識邁出了決定性的一步。原位PCR技術的出現使得生命科學在微觀領域的研究不再是可望而不可及。大規模、自動化基因測序技術的問世，使本世紀生命科學領域最宏大的研究項目——人類基因組計劃的實施比預期一再提前。而后基因組時代，即功能基因組和蛋白質組計劃的實施所必需的高通量、大規模篩選對分析方法又一次提出了挑戰。已發展了一百多年的質譜技術，由于其所具有的高靈敏度、高準確度、易于自動化等特點，毫無疑問地成為解決上述問題的關鍵手段之一。
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自1886年Goldstein發明早期質譜儀器常用的離子源，到1942年第一臺單聚焦質譜儀商品化，質譜基本上處于理論發展階段。隨后質譜在電離技術和分析技術上的發展和完善，使之很快應用于地質、空間研究、環境化學、有機化學、制藥等多個領域。然而，即使在等離子體解吸（plasma desorption,PD)和快原子轟擊（fast atom bombardment,FAB)兩項軟電離質譜技術出現以后，質譜分析的相對分子質量也只是在幾千左右。真正意義上的變革以80年代中期出現的兩種新的電離技術：電噴霧電離（electrospray ionization,ESI）〔1〕和基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted
laser desorption ionization,MALDI）〔2〕為代表，這兩種技術所具有的高靈敏度和高質量檢測范圍，使得在fmol（10-15）乃至amole（10-18）水平檢測相對分子質量高達幾十萬的生物大分子成為可能，從而開拓了質譜學一個嶄新的領域——生物質譜，促使質譜技術在生命科學領域獲得廣泛應用和發展。
? 2 生物質譜儀
目前商業化的生物質譜儀，其離子化方式主要是電噴霧電離與基質輔助激光解吸電離，前者常采用四極桿質量分析器，所構成的儀器稱為電噴霧（四極桿）質譜儀（ESI-MS），后者常用飛行時間作為質量分析器，所構成的儀器稱為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）。ESI-MS的特點之一是可以和液相色譜、毛細管電泳等現代化的分離手段聯用，從而大大擴展了其在生命科學領域的應用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫學的應用等；MALDI-TOF-MS的特點是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。此外，可用于生物大分子測定的質譜儀還有離子阱（ion trap,IT）質譜和傅里葉變換離子回旋共振（Fourier transform.
ion cyclotron resonance,FTICR）質譜等。而最近面市的最新型的生物質譜儀是液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間串聯質譜儀（LC-ESI-MS-MS）與帶有串聯質譜功能的MALDI-TOF質譜儀，前者是在傳統的電噴霧質譜儀的基礎上采用飛行時間質量分析器代替四極桿質量分析器，大大提高了儀器的分辨率、靈敏度和質量范圍，其商品名有Q-TOF〔4〕和Q-STAR〔3〕等；后者是在質譜中加入了源后降解（post-source
decay,PSD）模式或碰撞誘導解離（collisionally induced dissociation,CID）模式，從而使生物大分子的測序成為可能。
?3 生物質譜的應用
?3.1 蛋白質和多肽的分析
?3.1.1 分子量測定 分子量是蛋白質、多肽最基本的物理參數之一，是蛋白質、多肽識別與鑒定中首先需要測定的參數，也是基因工程產品報批的重要數據之一。分子量正確與否往往代表著所測定的蛋白質結構正確與否或者意味著一個新蛋白質的發現。生物質譜可測定生物大分子分子量高達40萬，準確度高達0.1%～0.001%，遠遠高于目前常規應用的SDS電泳與高效凝膠色譜技術。
?3.1.2 肽譜測定 肽譜是基因工程重組蛋白結構確認的重要指標，也是蛋白質組研究中大規模蛋白質識別和新蛋白質發現的重要手段。通過與特異性蛋白酶解相結合，生物質譜可測定肽質量指紋譜(peptide
mass fingerprint,PMF)，并給出全部肽段的準確分子量，結合蛋白質數據庫檢索，可實現對蛋白質的快速鑒別和高通量篩選。PMF常和膠上原位酶解相結合，成為蛋白質組研究中必不可少的一種手段〔5,6〕。此外根據肽段質量數變化，可對基因產品的插入、缺失、突變進行對比分析。
?3.1.3 肽序列測定技術 構成蛋白質的常見氨基酸有20種，一段3個氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式，4個氨基酸將有160 000種排列方式，即一個特定的4個氨基酸序列的出現概率為1/160000。因此，即使對于一個相當大的蛋白質組來說，五、六個氨基酸殘基的序列片段已具有很高的特異性。串聯質譜技術可直接測定肽段的氨基酸序列，從一級質譜產生的肽段中選擇母離子，進入二級質譜，經惰性氣體碰撞后肽段沿肽鏈斷裂，由所得到的各肽段質量數差值推定肽段序列，用于數據庫查尋，稱之為肽序列標簽技術（peptide
sequence tag,PST）〔7,8〕，目前廣泛應用于蛋白質組研究中的大規模篩選。較之傳統的Edman降解末端測序技術，生物質譜具有不受末端封閉的限制、靈敏度高、速度快的特點。另外，一種間接的肽序列測定技術即肽階梯序列技術（peptide
ladder sequence）〔9，10〕，通過末端酶解或化學降解，產生一組相互之間差一個氨基酸殘基的多肽系列，經MALDI-TOF-MS鑒定后，由所得到的肽階梯圖中各肽段的分子量差值確定末端的氨基酸序列，從而用于數據庫查尋。
?3.1.4 巰基和二硫鍵定位 二硫鍵在維持蛋白和多肽三級結構和正確折疊中具有重要作用，同時也是研究翻譯后修飾所經常面臨的問題，自由巰基在研究亞基之間及蛋白與其他物質相互作用中具有重要意義。利用碘乙酰胺、4-乙烯吡啶、2-巰基蘇糖醇等試劑對蛋白質進行烷基化和還原烷基化，結合蛋白酶切、肽譜技術，利用生物質譜的準確分子量測定，可實現對二硫鍵和自由巰基的快速定位與確定〔11〕。這在含有多二硫鍵結構的活性多肽與蛋白質研究中有重要用途。
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3.1.5 蛋白質翻譯后修飾 蛋白質在翻譯中或翻譯后由于不同功能所需會發生二十多類修飾，其中最常見的是磷酸化和糖基化，這些修飾將影響蛋白質的電荷數、疏水性、構象和穩定性，進而影響其生物活性，因此，在基因工程重組蛋白評估時，翻譯后修飾也被認為是影響活性的一個重要因素。傳統的Edman降解技術會破壞蛋白質修飾，肼解方法雖能得到糖鏈并鑒定之，但卻不能進行糖鏈的準確定位。結合肽譜和脫磷酸酶作用，目前已可以用MALDI-TOF-MS對雙向電泳分離蛋白質磷酸化位點進行定位〔12〕。凝集素可對糖鏈進行特異性吸附，利用這一性質，可用凝集素對糖蛋白酶解后的肽混合物進行選擇性吸附，MALDI-TOF-MS測定質量數，再用糖苷酶降解含糖肽，質譜測定后即可確定糖鏈的大小，結合不同的酶解方式可確定糖基化位點〔13〕,選擇不同的凝集素,還可確定糖鏈的連接方式。串聯質譜技術中子離子掃描模式可以快速選擇被修飾片段，然后可根據特征丟失確定修飾類型〔14〕，是目前最有效的對蛋白質翻譯后修飾進行識別與鑒定的分析手段。這方面的研究已有大量文獻報道。鑒于修飾的多樣性，目前已有人結合生物質譜技術，通過分析數千例蛋白質翻譯后修飾，建立蛋白質修飾數據庫FindMod〔15〕，其完善和發展必將推動蛋白質大規模鑒定的進程。
?3.1.6 生物分子相互作用及非共價復合物 蛋白質與其他生物分子相互作用在信號傳導、免疫反應等生命過程中起重要作用。軟電離技術的發展，促進了生物質譜在蛋白質復合物研究中的應用，目前已涉及了分子伴侶對蛋白折疊作用、蛋白/DNA復合物、RNA/多肽復合物、蛋白質-過渡金屬復合物及蛋白-SDS加合物等多種類型的復合物的結構及結合位點的研究〔16～20〕。
?3.2 多糖結構測定
?多糖的免疫功能是近年來研究的熱點領域，其結構的測定是功能研究的基礎。多糖不像蛋白質和核酸，其少數的分子即可由于連接位點的不同，而形成復雜多變的結構，因而難以用傳統的化學方法研究。生物質譜具備了測定多糖結構的功能，配以適當的化學標記或酶降解，可對多糖結構進行研究〔21〕。采用MALDI-TOF-MS已對糖蛋白中的寡糖側鏈進行了分析，包括糖基化位點、糖苷鍵類型、糖基連接方式以及寡糖序列測定〔22〕等。與傳統的化學方法相比，質譜技術具有操作簡便、省時、結果直觀等特點。
? 3.3 寡核苷酸和核酸的分析
? 目前，生物質譜已經實現對數十個堿基寡核苷酸的分子量和序列測定〔23〕，此技術可用于天然或人工合成寡核苷酸的質量控制。人類基因組有30億個堿基，但真正與疾病有關的目前僅知道只是少數可變的基因。基因庫中有一個很豐富的資源即300萬個單核苷酸多態性片段（SNP），它是一類基于單堿基變異引起的DNA多態性，由于其位點豐富（每一千個堿基約一個多態性），使得在鑒定和表征與生物學功能和人類疾病相關的基因時，它可作為關聯分析的基因標志。SNP不一定要準確定位，關鍵是測定其在種群中出現的頻率及其遺傳和表型的關系，這便需要高通量的測定技術。生物質譜可以通過準確的分子量測定，確定SNP與突變前多態性片段分子量差異，如堿基由A突變為C后，SNP分子量增加24.025，突變為G時，增加15.999，由分子量的變化可推定突變方式。一種快速而經濟的方法是利用目前不斷成熟的DNA芯片技術和質譜檢測相結合，將雜交至固定化DNA陣列上的引物進行PCR擴增后，直接用質譜對芯片上SNP進行檢測，該法將所需樣品的體積由微升減至納升，且有利于自動化和高通量的測定〔24〕。Griffin等〔25〕用浸入剪切分析（一種不經PCR而可以直接進行SNP分析的信號放大方法）結合MALDI-TOF-MS分析人基因組SNP，該法既節省時間，又適于高通量分析，有利于特異性基因的定位、鑒定和功能表征。
? DNA在內環境中的溫度、pH、機體代謝過程產生的超氧化物自由基、外環境中的各種化學物質（如烷化劑）、物理因素（紫外線等）各種條件作用下，都可能發生損傷，若損傷不能及時修復，就會產生嚴重的生物學后果。DNA損傷不僅包括DNA分子中的堿基，而且還包括脫氧核糖和磷酸，其中堿基損傷最厲害，造成的后果也最嚴重。堿基錯配、電離輻射導致串聯損傷、活性氧損傷、過渡金屬Cr(Ⅲ)復合物與DNA作用引發的損傷以及致癌劑對DNA損傷等的生物質譜研究多有報道〔26～30〕。
? 3.4 藥物代謝
近年來質譜在藥物代謝方面的研究進展迅速。其主要研究藥物在體內過程中發生的變化，闡明藥物作用的部位、強弱、時效及毒副作用，從而為藥物設計、合理用藥提供實驗和理論基礎。特別是采用生物技術獲得的大分子藥物的體內代謝研究，更是傳統的研究手段難以解決的難題。體內藥物或代謝物濃度一般很低，而且很多情況下需要實時檢測，而質譜的高靈敏度和高分辨率以及快速檢測則為代謝物鑒定提供了保證。LC-ESI-MS-MS在這方面有獨特的優勢，由于對液態樣品和混合樣品的分離能力高，可通過二級離子碎片尋找原型藥物并推導其結構，LC-ESI-MS-MS已廣泛地應用于藥物代謝研究中一期生物轉化反應和二期結合反應產物的鑒定、復雜生物樣品的自動化分析以及代謝物結構闡述等〔31,32〕。
? 3.5 微生物鑒定
? 微生物的檢驗在環境監測、農產品分析、食品加工、工業應用、衛生機構維護及軍事醫學中都很重要，其重點主要在于微生物的分類鑒定上。由于微生物成分一般不是特別復雜，目前的ESI和MALDI技術已可以在其全細胞水平展開。
? 在對微生物全細胞蛋白成分的鑒定上，可用MALDI-MS或ESI-MS對裂解細胞直接檢測，測定其全細胞指紋譜，找出種間和株間特異保守峰作為生物標記（biomarker）〔33〕,以此來進行識別。美國軍方已經開展這方面的研究，其目的是通過大量指紋譜的測定，構建數據庫，以實現對細菌等微生物的快速鑒定。細菌鑒定的另一個主要方法是細菌的脂肪酸圖，即細菌脂類水解后釋放出脂肪酸，將這些脂肪酸甲基化后分離檢測所得到的圖譜。傳統上用氣相色譜（GC）分離，火焰離子檢測器檢測，速度慢且麻煩，質譜軟電離技術的出現大大提高了其鑒定速度。有報道用熱裂解甲基化法結合離子阱質譜來區分20多種細菌〔34〕。除了生物標記和脂肪酸作圖外，也有人用細菌糖類化合物作圖，來作為細菌鑒定的依據，同時也用它來描述細胞所處的生理狀況〔35〕。
? 生物除污（bioremediation)是利用微生物把污染物轉換為低害或無害物。特異降解微生物的選擇及其代謝性能的鑒定是該技術的關鍵。MALDI-TOF-MS多次被用于監測細菌的降解能力以及在外界刺激條件下細菌蛋白質組的變化〔36，37〕。
? 3.6 其他應用
質譜在醫用材料如人工血、新型生物假肢、人工皮膚等研究中也有較大的潛在用途。主要是分析檢測這些材料中活性物質的純度、濃度及結構等，這是生物材料質量控制的重要依據之一。
