多糖組成分析－HPLC法

1 衍生化試劑：

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，使用前在甲醇中重結晶兩次。

2 原理：

還原糖在一定條件下可以與PMP進行縮合反應，生成糖－PMP復合物，衍生化方法因為不損失唾液酸，所以對單糖或寡糖特別有效。

3 方法：

（1）多糖水解：精確稱取當歸多糖樣品20 mg于安瓿中，分別加入2 mol/L TFA，2 mol/L H2SO4 以及其混酸溶液2.0 mL，充氮氣封管，110度水解10 h。冷卻至室溫，反應混合物1000 r/min離心5 min，取上清液用0．3 mol/L NaOH溶液中和到約pH 7.0，溶液用于PMP衍生。多條的水解方法很多，具體地可以查詢張惟杰主編的糖復合物生化技術等書籍；

（2）衍生：將待測樣品0.1 mL置于具塞試管中，加入20 uL PMP溶液(0.5 mol/L 甲醇溶液)和20 uL氫氧化鈉溶液(0.3 mol／L)，混勻后置于70度水浴中加熱反應30 min，取出室溫放置10 min；再加入25 uL鹽酸溶液(0.3 mol/L)中和，混勻后用0.5 mL 乙酸異戊脂萃取，渦旋3 min，離心15 min，小心棄去有機層，再萃取一次得到下層，加水150 L混勻并離心15min，用于HPLC分析。

    注：萃取劑也可以是氯仿，甲酸異戊酯等與水不互溶的有機溶劑；PMP在使用前必須重結晶。

4 HPLC 分析

    色譜柱： C18

    溶劑A：15％(v/v)ACN+0.05M PBS(KH2PO4-NaOH，

          pH6.9)；溶劑B，40％(v/v)ACN+0.05M PBS (同上)；

    梯度：0-10-30 min， 0-8％-20％ B

    柱溫：室溫

        UV：250nm