蛋白質樣品的酶切處理秘笈

1 蛋白質濃度最好不要太低，一般不要低于500ug/ml，這樣可以保證質譜分析后的多肽覆蓋率。蛋白質組學研究中的樣品多肽覆蓋率的主要原因是部分蛋白屬于低豐度蛋白(微量或痕量)，進行質譜分析時離子信號強度低常導致二級質譜圖中b離子和y離子的數量和連續性差，得到許多無效的質譜數據，因此覆蓋率低。

2 蛋白質變性：進行酶解之前，蛋白質溶液中可以加入2 mol/L的脲或將蛋白質溶液熱處理，可以保證蛋白質處理伸展狀態，蛋白質易被酶切。蛋白質的結構復雜性導致其序列中部分酶切位點被包埋在其它結構域中，或其結構易干擾酶切過程，因此，酶切容易不完全。部分蛋白必須變性之后才能被酶切，如在天然狀態下膠原蛋白只能被膠原酶降解，而不能Trypsin，chymotrypsin，pepsin等酶降解。蛋白質溶液中2 mol/L的脲對Trypsin的活性幾乎沒有影響。

3 酶解后的樣品最好經DTT處理打開全部二硫鍵后再進行HPLC-MS分析，（二硫鍵定位分析除外）。其原因在于蛋白質經酶處理后部分多肽通過二硫鍵連接，或通過原來的分子間二硫鍵連接，因此未經DTT處理后的蛋白質酶解后直接進行HPLC-MS分析多肽檢出率會不高（不含二硫鍵蛋白除外）。

4 酶解的蛋白質溶液需要除微生物，兩種方式：保證蛋白質溶液相對干凈的條件下在超凈工作臺上加入酶或變性劑；或在常規環境中配置好后進行離心，取上清液進行恒溫處理，但會損失部分工具酶。

5 酶和蛋白的比例影響最佳酶解時間，一般控制在1：50到1：200，當蛋白質濃度較高時，相同體積的樣品需要的樣品量比較高，因此，最好將蛋白質溶液放在200ul的小玻璃管內酶解，這樣可以節省酶（如Trypsin）的用量。Trypsin最好要用sequence grade的（Promega或Roche都可以），以保證純度及酶解位點的特異性。

6 使用Trypsin做工具酶時，蛋白質最好溶解在0.05mol/L的NH4HCO3溶液中，同時加入2M的脲，如果蛋白質原溶液中屬于其它緩沖液且pH偏離8.0時，溶液需要使用凝膠過濾進行置換。