二硫鍵定位分析步驟

蛋白理論分子量為M1，有n個半胱氨酸（Cys）

Step 1 直接使用質譜測定該蛋白質的分子量，得到MW－2x；然后用DTT將全部

       二硫鍵打開得到M1，則   x即為該蛋白含有的二硫鍵的個數。

Step 2 將該蛋白利用4－VP處理得到分子量MW＋105y，y即為該蛋白含有的游離

       巰基的個數，則x＋y＝n

Step 3 將該蛋白利用合適的酶進行酶切（trypsin，chymotrypsin...），液質聯用

       分析或MALDI－TOF MS 分析得到肽譜，計算理論上出現的肽段以及實際得

       到的多肽片段。

Step 4 將酶解得到的多肽混合物用DTT將全部二硫鍵打開，聯用分析，與3得到的

       肽斷混合物比對，計算出現的新肽斷，則二硫鍵位于新出現的肽斷之間。

       如 DTT處理后的多肽混合物中檢測出多肽P1和P2， Step 3中未檢測出這兩

       個多肽，但檢測出質荷比m/z = P1＋P2－3的多肽，這P1和P2之間存在二

       硫鍵；

Step 5 如果一個肽段上有兩個cys，則需要先利用4－vp處理蛋白，然后酶解，DTT

       還原，將目標肽斷進行MS3分析，即得到同一肽段上那個Cys以二硫鍵的

       形式存在；

Step 6  如果兩個disulfide交叉，則需要利用分部還原，多用TCEP。

Step 7  常用還原二硫鍵的試劑DTT，TCEP， 常用衍生Cys上的巰基的試劑有4－

              vp等。