Apogee納米流式用戶連發JEV文章解析外泌體精準分析方法

隨著以英國Apogee Flow公司為代表推出納米流式分析技術的發展，外泌體微囊泡（EVs）采用納米流式進行快速多參數精準分析的方案，引起越來越多人的關注。使用此方案分析EVs，不僅對所用儀器性能要求很高，樣品分離標記等前處理工作也至關重要。由于EVs與脂蛋白顆粒（LPs）大小和密度等方面的分布重疊性，目前尚無特效方法可將其完全分離開。特別是血漿類樣品，不僅包含不同血細胞來源的EVs，腫瘤細胞等特異疾病組織來源的EVs，更是包含數量遠多于EVs的LPs。目前血漿樣品分離提取的EVs，往往伴隨著大量未除去的LPs。當前分離技術條件下，采用納米流式如何更好地對EVs進行單顆粒特異精準分析呢？

荷蘭學者Edwin van der Pol之前發表創新研究新成果[1]，即通過Apogee納米流式散射光比例分析法（Flow-SR，不同散射光檢測器收集信號的比值），實現對納米顆粒大小及折射率（RI）進行精準分析。文章指出，由于樣品RI不同，不能簡單用單一角度散射光直接估算樣品大小（圖1A和1B，相同強度散射光，不同RI樣品，對應直徑大小不同）。即使結合Mie光散射理論，可以對特定RI樣品進行矯正分析，但是對于EVs來說，由于不同EVs大小及內含物差異，同樣是EVs，其RI也是差異顯著（一般RI：1.36-1.45之間）。所以直接用單一散射光結合RI矯正進行EVs大小分析，嚴格來說誤差會很大的。

圖1，通過Flow-SR分析納米顆粒大小和折射率

而Flow-SR分析法，在一定大小范圍內不受樣品折射率的影響，是精準分析EVs大小的更佳方案（圖1C）。在此基礎上，該研究通過Flow-SR以及相應樣品直徑大小信息，進一步計算獲得不同樣品的RI，從而又為不同大小，不同RI的EVs精確分析提供了可能（圖2）。

圖2，通過Flow-SR分析EVs大小和RI。A，前向角和側向角散射光分析EVs；B，不同EVs大小及RI分析；C，特異CD61+抗體熒光標記的EVs （大小及RI分析）

熒光標記是EVs精準分析的另一個重要方面。目前，分析特異熒光標記效率的方法，主要有，a）使用抗體isotype同型對照；b）在處不同理樣品之間比較；c）選擇EVs特異的裂解液。以上這些方法都沒有直接分析抗體染料和樣品本身（特別是對于混合有LPs和EVs樣品）直接的作用情況，實際上仍不是最理想的方案。理論上，使用染料/熒光標記抗體本身做參照直接分析才是更理想的分析方案。Edwin van der Pol又與其他研究小組合作，在上述Flow-SR研究方案基礎上，首次將Flow-SR及獲得的RI成功應用于EVs特異性熒光標記效率分析[2]（圖3）。

圖3 不同染料對相同EVs和LPs混合類樣品進行分析。由于EVs和LPs的折射率明顯不同（EVs RI <1.42, LPs RI >1.42），通過Flow-SR及RI分析可精細分析不同染料標記，不同納米顆粒樣品的特異性標記效率

在日前剛發表的另一篇文章中[3]，Edwin van der Pol與其他研究人員繼續合作，充分利用Apogee納米流式多角度超靈敏散射光（市場唯一可通過多個角度散射光分析100nm左右EVs樣品），通過Flow-SR，來進行納米顆粒尺寸大小，RI分析，并通過RI信息，進一步區分EVs與LPs（圖4），為特異精準分析EVs大小，抗體/染料熒光特異標記效率，提供了更理想的應用方案。

圖4 利用Flow-SR分析技術對不同大小EVs和LPs混合樣品進行大小，RI和計數分析。左圖，圈門區域分析RI<1.42 EVs樣品，左圖，圈門區域分析RI>1.42 LPs樣品

綜上所述，以上研究成果在充分利用Apogee超靈敏納米流式分析儀對EVs傳統應用方案基礎之上，突破了僅用一個角度超靈敏散射光進行納米顆粒檢測的應用限制，進一步成功開發新的Flow-SR特色分析技術，將超靈敏納米流式多角度散射光比例分析（Flow-SR）用于外泌體微囊泡大小，折射率以及熒光特異性標記效率分析。利用Flow-SR分析技術獲得直徑大小及折射率信息，不僅為區分未去除的脂蛋白納米顆，精準分析外泌體微囊泡，也為其他納米顆粒類樣品提供了納米流式分析前沿應用方案。

參考資料

1. van der Pol E, de Rond L, Coumans FAW, et al. Absolute sizing and label-free identification of extracellular vesicles by flow cytometry. Nanomedicine. 2018

2, de Rond L, Libregts SFWM, Rikkert LG, et al. Refractive index to evaluate staining specificity of extracellular vesicles by flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2019

3, Agustin Enciso-Martinez, Edwin Van Der Pol, Chi M. Hau, et al. Label-free identification and chemical characterisation of single extracellular vesicles and lipoproteins by synchronous Rayleigh and Raman scattering. J Extracell Vesicles. 2020