獸藥殘留分析方法詳解

　　內容摘要：免疫分析技術(IAs)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析技術，小分子量的獸藥(Mw<25()())一般不具備免疫原性，不能刺激動物產生免疫反應。將獸藥小分子以半抗原的形式通過一定碳鏈長度的連接分子與分子量大的載體(一般為蛋白質)以共價鍵相偶聯制備成人工抗原，使動物的免疫系統發生應答反應，產生對該獸藥具特異性的活性物質(免疫球蛋白或稱抗體)來識別該獸藥分子并與之結合。這樣的結合反應不僅可在體內進行，也可在體外進行，符合質量作用定律，這就是免疫分析的基礎。

　　氣相色譜法、液相色譜法等與質譜的聯用技術是獸藥殘留分析常用的定量及確證方法，具有高度選擇性和可靠性，在代謝物結構和代謝途徑及其藥理學與毒理學作用的分子基礎研究中具有非常廣闊的前景。現在就一些農業獸藥殘留的檢測方法做簡要的介紹。

　　1.免疫分析技術

　　免疫分析技術(IAs)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的分析技術，小分子量的獸藥(Mw<25()())一般不具備免疫原性，不能刺激動物產生免疫反應。將獸藥小分子以半抗原的形式通過一定碳鏈長度的連接分子與分子量大的載體(一般為蛋白質)以共價鍵相偶聯制備成人工抗原，使動物的免疫系統發生應答反應，產生對該獸藥具特異性的活性物質(免疫球蛋白或稱抗體)來識別該獸藥分子并與之結合。這樣的結合反應不僅可在體內進行，也可在體外進行，符合質量作用定律，這就是免疫分析的基礎。一旦制備出特異性抗體，IAs有許多模式供選擇，靈活多樣，新的分析手段和應用不斷出現，這是幾十年來對IAs的研究經久不衰的重要原因。按照標記物或檢測體系來劃分，IAs可分為放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA)、熒光免疫測定法 (FIA)、化學發光免疫測定法(C1A)、固相免疫傳感器等;按反應介質分為均相或非均相免疫測定法。與常規理化分析技術相比，免疫分析具有特異性強、靈敏度高(檢測限可達1弘g～1pg)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優點。

　　樣本前處理步驟最能體現IAs的優越性。常規的理化測定技術，如高效液相色譜(HPLC)或Gc，通常需要煩瑣的樣本前處理操作(樣本提取、凈化、濃縮和衍生化)，前處理至少占用70%以上的分析工作量。IAs有很高的選擇性，前處理要求簡單，一般僅需提取就足夠了，少數情況如高脂肪樣本需一定凈化步驟;IAs有很高靈敏性，可使用稀釋樣本或提取液的方式消除基質的干擾，能進一步簡化操作，如動物組織中氯霉素、磺胺二甲基嘧啶和阿維菌素殘留的測定。 IAs取樣量少、前處理簡單、儀器化程度低，分析效率約為HPI。c或Gc的幾十倍;IAs不存在HPLC或Gc對待測物蒸氣壓、熱穩定性、鹵素、發色團等理化性質的限制，特別適用于難氣化或難分離的高極性/離子型獸藥或大分子化合物的分析。IAs已在大批量樣本中某些獸藥殘留的快速篩選性檢測和常規分析技術測定困難的獸藥的分析中占據主流地位。以下就一些免疫分析技術方法做簡要的介紹。

　　(1)酶免疫測定法(EIA) 酶免疫測定法是20世紀70年代發展起來的非同位素IAs，其使用酶進行標記，避免了同位素標記的放射性污染和標記物的穩定性問題，操作方便，儀器簡單。在獸藥殘留快速分析中應用最廣泛的是酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，目前望爾生物公司等食品藥殘檢測技術研究單位已有近二十多種用于獸藥殘留檢測的商品化ELISA試劑盒。 ELISA檢測方法屬于非均相免疫分析技術，一般將抗原或抗體吸附于固相載體(包被抗原或抗體)，加入酶標記，抗原或抗體以及待測物，進行競爭性免疫反應，反應達平衡后，傾去反應液，洗滌酶標板，即從非標記物中物理分離結合的標記物，再加入酶的底物，進行酶促反應約30min，經酸固定停止顯色反應后，再分光光度法進行檢測。由于近年來各專業性公司在包被抗原、特異性抗體(尤其是單克隆抗體)、酶、顯色系統制備方面，以及在ELISA反應條件、緩沖液系統的研究方面取得了突破性進展，使商業化ELISA試劑盒無論在靈敏度、穩定性、精密度方面均達到了獸藥殘留檢測的要求，加上其操作簡便、儀器化程度低和成本適中等優點，ELISA試劑盒已成為目前國內外獸藥殘留檢測的主流技術。

　　(2)熒光免疫測定法(FIA) 熒光免疫測定法(FIA)為僅次于EIA的非同位素IAs，使用普通光激發熒光物質的FIA，由于易受背景干擾等原因，限制了FIA的靈敏度。近年來發展起來的熒光偏振免疫測定法(FPIA)、熒光淬滅免疫測定法(FQIA)和時間分辨熒光免疫測定法(TrFIA)，大大提高了FIA的靈敏度(可達 10_1’～10一加mol/L)。使得FIA在環境監測、醫學和藥物殘留方面的應用得到進一步發展。

　　(3)熒光偏振免疫測定法(FPIA) 熒光偏振免疫測定法(FPIA)是一種使用熒光物質作為標記物的免疫測定法，使用普通光激發熒光物質后得到的都是普通熒光，當使用偏振光作為激發光時，視分子的運動狀態，發射的熒光可能是振動方向隨機化的普通熒光，或是只在某一平面振動的偏振熒光。在反應液中，游離的標記藥物分子體積小，在布朗運動中轉動速度快，受偏振光照射后產生熒光的偏振方向被分散(隨機化)，不能形成偏振光，只發射普通熒光;與抗體結合的標記藥物分子體積大，布朗運動速度緩慢，甚至不能轉動而形成定向排列，所以受偏振光激發后能產生偏振熒光。該方法靈敏度高，抗背景干擾性強，適用于復雜基質中痕量組分的分析。

　　(4)膠體金免疫測定法膠體金免疫測定法是在免疫滲濾的基礎上建立的一種簡單快速的免疫學檢測技術，它往往以條狀纖維層析材料為固相(通稱試紙條)，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截流在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過酶反應或直接運用可目測的標記物(如膠體金)而得到直觀的實驗現象(如顯色)。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。1971年，Faulk和Taylor首次用膠體金標記技術研究沙門氏菌細胞抗原成分，將膠體金與抗原結合，應用于電鏡水平的免疫細胞化學研究。隨后膠體金技術不斷發展，出現了標記抗球蛋白抗體的間接免疫金染色法，并開始應用于各種藥物殘留和環境分析中。這種方法靈敏度較高，操作簡便快速，分析結果易于判定，特別適用于殘留監控中現場的快速篩選性監測分析。

　　(5)免疫傳感器 免疫傳感器是生物傳感器的一種，傳感器的生物敏感層與復雜樣品中特定的目標分析物之間通過抗體與抗原之間的識別反應，產生一些物理化學信號(如光、熱、聲、質量、顏色、電化學等)的變化，這些變化通過不同原理的傳感器(如光敏管、壓電裝置、光極、熱敏電阻、離子選擇性電極等)轉換成第二信號(通常為電信號)，經放大后顯示或記錄。利用獸藥與特異性抗體結合反應特性研制出的免疫傳感器，可用于對相應獸藥殘留進行快速定量定性檢測。免疫傳感器的最大特點是便攜性，免疫傳感器高度的自動化、微型化與集成化減少了對使用者及環境技術條件的依賴，測定速度快，適合現場或野外進行快速篩選檢測。