免疫分析技術----熒光免疫測定法與酶免疫測試法

　　內容摘要：在農藥殘留分析中用的最多的是酶聯免疫吸附測定法，很適合攜帶到現場監測，對于呈陽性反應的繼之以氣譜或液譜測定，可以減少不必要的浪費和污染，適應了環保的需要。

　　1.熒光免疫測定法

　　熒光免疫測定法(FIA)是將抗血清、待測農藥、熒光標記的待測農藥混在聚苯乙烯管中，經培育后加入廣球蛋白和分子量為6000的聚乙二醇使與之結合的待測農藥和熒光標記的農藥沉淀下來;未被結合的熒光標記的農留在上清液中。當抗血清與熒光標記農藥的量一定時，含待測農藥多的試管中，抗體結合的熒光標記農藥少，上清液中游離的熒光標記的農藥就多，即待測物含量與游離的熒光標記物含量成正比，測定上清液的熒光強度，即可算出待測物含量。

　　S.A.EreminLH。]報道了用偏振熒光免疫測定法(PFIA)來檢測許多環境樣品中的農藥殘留。當熒光團標記半抗原被特別的抗體束縛時，PFIA就提高了熒光的極化，當自由分析物與半抗原為結合而競爭時，就減弱了信號;該法并不需要分離自由態和結合態的分析物。PFIA法適合于檢測西瑪津、阿特拉津等，10個O.05mI。的水樣在7min內即可分析完畢;阿特拉津的檢出限為100ng/mL，西瑪津為5ng/mL，變異系數小于5%。calatayud[H’]報道了用FIA測定3吲哚乙酸殺蟲劑，具有高選擇性，線性范圍 0.005～O.6mg/L，相對標準偏差為4.9%。

　　2.酶免疫測試法

　　農藥殘留檢測中最常用的是酶免疫法。近年來，免疫分析法尤其是酶免疫分析(EIA)的研究十分活躍，應用領域也取得了較大的擴展。EIA被稱為使用抗體作為“生物化學檢測器”的分析技術，是基于抗原抗體特異性識別和結合反應為基礎的分析方法。大分子量的農藥(如蘇云金桿菌毒素等)可以直接作為抗原免疫脊椎動物，動物的免疫系統對進入體內的異源大分子量物質發生保護性應答反應。

　　1975年首次成功地將EIA用于狄氏劑殘留的測定。20世紀80年代中期以來，EIA在農藥分析中的應用日益增多，且逐漸由多抗轉向單抗，其檢測手段多為ELISA。近年來，國內外已經開發出40多種農藥的EIA方法，其中用于田間快速篩選的EIA試劑盒已商品化。EIA在除草劑和殺蟲劑中應用較多，而殺菌劑較少。Brandon[¨。]等利用EIA分析食品中的苯并咪唑農藥殘留。EIA具有特異性強、靈敏度高(檢測限可達10叫～10叫。)、方便快速、分析容量大、分析成本低、安全可靠等優點。EIA也有其局限性和不利之處，如：開發過程需要投入較多的資金和時問，得到一個好的抗原并不容易，對試劑的選擇性高，很難同時分析多種成分，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應。農藥酶免疫測試法是用酶標記抗原、半抗原或抗體而建立的方法。根據其特點和步驟可分為酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和酶放大免疫測試法(EMIT)。

　　(1)酶聯免疫吸附測定法 20世紀80年代，食品農藥殘留的免疫學檢測技術研究取得了較大的進展，特別是酶聯免疫吸附技術使用最為廣泛。ELIsA是一種主要的免疫分析方法，又可分為直接競爭法和問接競爭法。直接競爭法是將抗體包被到聚苯乙烯微孔反應板上，加入酶標記農藥和待測農藥，酶標記農藥和待測農藥之間與抗體的競爭而發生結合反應，反應完后，倒掉反應液并洗滌，待測農藥多，則被吸附到反應板上的酶標記農藥少，即吸附到酶反應板上的酶標記農藥的量與待測液中農藥的含量成反比。加入酶底物顯色后，進行比色，可以測定待測農藥含量。間接競爭法的前一部分與抗原包被直接競爭法相同，只是不用酶標記農藥抗體(一抗)，而是標記第二抗體，在競爭反應結束后，加入酶標二抗，發生一抗與酶標二抗的結合反應，被結合的酶標二抗的量與包被抗原結合的一抗的量的變化趨勢是一致的，即被結合的酶標二抗的量與待測農藥的含量成反比。此方法的優點是一個農藥抗體可以結合多個酶標二抗，大大提高了方法的靈敏度。

　　在農藥殘留分析中用的最多的是酶聯免疫吸附測定法，很適合攜帶到現場監測，對于呈陽性反應的繼之以氣譜或液譜測定，可以減少不必要的浪費和污染，適應了環保的需要。 EuSA利用酶標記抗體或抗原，通過抗原與抗體之間的ELISA反應依靠比色法來確定農藥的殘留量，該方法特異性強、靈敏度高、快速、靈敏、價廉、不需煩瑣的預處理，已經成為現場分析的首選方法。該方法的缺點是制備抗體較困難，可能會出現假陽性或假陰性現象。一些檢測商品試劑盒也相繼研究開發出，美國Immuno systems公司在1991年已生產出10余種以ELISA為基礎的農藥酶免疫速測箱，用于測定水、果汁以及部分食品乙腈提取液中的殺蟲劑、殺菌劑、除草劑，檢測限在。mg/kg級，與HPLC比較有較好的相關性。

　　在1994年制備了一種可以與苯并咪唑類藥劑(丙硫多菌靈、芬苯達唑、奧芬達唑及它們的代謝物)結合的單克隆抗體，該抗體也可與甲基苯并咪唑氨基甲酸酯(苯菌靈的一種代謝物)結合。新的半抗原5(6)一(羥基戊基一硫代)一2一苯并咪唑氨基甲酸酯可在大鼠體內得到，這種改進了的EI。ISA法可以檢測苯并咪唑及多種農藥，它們的檢出限為1～8pg/kg。Brandon[143’報道了可用單克隆抗體ELISA法來檢測西紅柿和蘋果中的噻菌靈，噻菌靈用水或緩沖液萃取即可，這種單克隆抗體可與噻菌靈結合，ELISA法對噻菌靈的檢出限小于0·2mg/kg，由于美國聯邦政府規定的噻菌靈在西紅柿和蘋果中的限定濃度為10mg/kg，故該法能直接滿足要求。Selisker‘等[’。。]采用競爭ELlsA法用兔抗百草枯抗體包被磁株固相檢測百草枯，從各種水果和蔬菜中提取百草枯只用30min，檢出限為10ng/g，平均回收率達99%，而用分光光度計法樣品提取則需5h，兩種檢測方法相關系數達 o.994Schiaeppi等[145]運用直接競爭ELISA法和間接競爭ELISA法分別檢測土壤中的異丙甲草胺，產生的抗異丙甲草胺單克隆抗體有極強特異性，與其代謝產物無交叉反應，直接和間接競爭EusA法對土壤中異丙甲草胺的回收率分別為98%和89%。Clegg等[H。]建立了分析甘膦的 ELIsA法，其工作范圍為10～1000/~g/mL，檢出限為7.6肛g/mL。

　　研究表明，甲萘威的EUSA技術線性濃度范圍為10叫～10叫"g/mL，檢出限為O.1ng/mL。Beasley等[M。]報道了快速測定倉儲作物中的有機磷、殺螟松及乙基蟲螨磷類農藥的方法，將谷物中的農藥萃取到甲醇液中，酶標組分滴加至含有緩沖液的試管中，經短暫的培養后，加入酶作用的基質。酸化后顏色穩定，結果可直接用肉眼或光度計測定。由于濃度不同，顏色處于灰白至暗綠之問，可根據顏色的深淺與濃度對數的關系(使用農藥標準液) 來定量估計農藥的殘留水平。對殺螟松來說，檢出限為4扯g/mL(在谷物中0.1mg/kg)，定量估值范圍為o.5～15mg/kg(谷物)，乙基蟲螨磷的檢出限為1/*g/mL(在谷物中O.03mg/kg)，定量估值范圍為O.1～15：mg/kg。該法可用來分離測定在谷物中處于自由態的農藥(殘留低于0.1mg/kg)。Roberto[¨。]等報道了對比傳統免疫分析法RIA，ELIsA及生物傳感器在農藥殘留檢測與監控中的應用。文獻報道可用EIA分析的農藥有66多種，其中除草劑和殺蟲劑較多，殺菌劑較少。近幾年，雖然開發了一些農藥新品種，但不是很多，而在改進 EIA的使用技術，如由多抗轉向單抗、純化抗體和抗原、改進抗體的載體和反應環境以及定量分析等方面都取得了不少成就。

　　(2)酶放大免疫測試法(EMIT) 酶放大免疫測試法是一種經典的均質酶免疫測試技術，基本原理是用特定的酶標記待測農藥，然后將抗體、酶標記農藥、待測農藥同時加入反應試管中進行競爭反應，酶標記的待測農藥與抗體結合后，酶被抑制而失去活性，樣本中待測農藥越多，則游離的未被抑制的酶也越多，根據吸附反應后酶活性的改變可以測定出農藥的含量。該法的缺點就是每一種待測農藥都必須進行酶標記，限制了該法的推廣應用等報道了利用酶放大免疫技術測定擬除蟲菊酯殺蟲劑及衍生物，以細菌的淀粉酶為標記，檢測時間不超過45min，檢測限達到2～5ng/mL。