甲醛變性電泳檢測RNA完整性

　　甲醛變性電泳檢測RNA完整性

　　一、材料、試劑和儀器

　　1、材料：植物總RNA 5-10μg

　　2、試劑：

　　1)加樣運載緩沖液(Loading buffer)

　　50% 甘油

　　1mmol/L EDTA (pH 8.0)

　　0.25%溴酚藍

　　25%二甲苯氰FF

　　2)10×TAE Buffer

　　3)5×甲醛凝膠電泳緩沖液：

　　0.1mol/L MOPs (pH7.0)

　　40mmol/L乙酸鈉

　　5mmol/L DETA(pH8.0)

　　4)甲醛，甲酰胺

　　3、儀器：電泳裝置，紫外透射觀測儀

　　二、實驗程序

　　1、甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制

　　在250mL的錐形瓶中準確稱量2g Agarose (Sigama)，再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC處理過的雙蒸水，微波爐中化膠，待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛，放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

　　2、RNA的甲醛變性電泳

　　1) 樣品制備

　　RNA總量10μg

　　5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl

　　甲醛 3.5μl

　　甲酰胺10μl

　　加入無菌離心管中混合，95℃水浴變性2min(或55℃，15min)，取出后放入冰中冷卻。

　　2) 加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三： 增大樣品密度，以確保DNA均勻進入樣品孔內;使樣品呈現顏色，便于加樣操作;能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時，溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4kb 的雙鏈線狀DNA相同。)

　　3)將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中，點樣前5V/cm預跑5min。點樣后3-4V/cm電泳。

　　4)電泳結束后(溴苯酚藍遷移到約8cm處)，紫外燈下觀察， 照相