利用SMART技術進行酵母雙雜交文庫構建的研究

研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用不僅對于揭示生命活動如生長、發育、分化和凋亡等的機制具有重要的意義，而且為治療各種重大疾病和藥物研發等提供重要的理論基礎。酵母雙雜交系統是目前應用廣泛的一個較為成熟的研究蛋白質間相互作用的系統，越來越多的生物公司提供酵母雙雜交服務。酵母雙雜交技術是一種直接在酵母細胞內檢測蛋白質相互作用的方法，可以有效地篩選與已知靶蛋白相互作用的蛋白質，確定參與結合作用的結構域。  

酵母雙雜交技術的應用主要包括從基因文庫中尋找到與已知蛋白相互作用的未知蛋白，驗證兩種已知蛋白之間的相互作用，在基因治療中找到藥物的作用位點，同時可繪制蛋白質的連鎖圖譜并找到其作用的活性位點等。利用酵母雙雜交系統技術來篩選cDNA文庫中與目的蛋白相互作用的蛋白質，通常是把目的蛋白和BD相連，cDNA和AD相連構成cDNA文庫。 

酵母雙雜交文庫構建是篩庫的前提，其構建主要有2種策略，一種是合成的cDNA在體外通過連接酶和載體相連，然后轉化細胞。另一種是SMART技術，指的是合成的cDNA和線性化的載體共同轉化酵母，在體內重組酶的作用下cDNA和載體相連形成完整的質粒。通過SMART技術構建的cDNA文庫能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，保存了生物遺傳信息的完整性。美迪西提供酵母雙雜交服務，其具有獨立優質實驗室，專業實驗人員，提供詳細的酵母雙雜交實驗步驟、原始數據和圖片、結果分析，可以出具權威檢測數據報告。

1、利用SMART技術可進行中國人肝組織cDNA酵母雙雜交文庫構建

針對人類肝臟蛋白質組計劃中大規模基因克隆及構建肝臟蛋白相互作用圖譜的研究需要，研究者改造了酵母雙雜交載體pPC86和pDBleu，并構建中國人肝組織cDNA文庫，為肝臟蛋白質組計劃的研究奠定基礎^[1]。方法是設計并合成特定寡核苷酸序列，經過處理形成具有黏性末端的雙鏈DNA片段，插入到pPC86、pDBLeu載體相應的酶切位點處，從而獲得改造的新載體。

利用改造后的載體、中國人正常肝組織mRNA和Clontech SMART文庫構建試劑盒構建NpDBLeu-cDNA文庫。結果發現酶切鑒定和DNA測序證實改造后載體插入位點和序列正確，成功獲得新載體NpPC86和NpDBLeu。滴度測試表明，所構建NpDBLeu肝組織cDNA文庫容量為1.93×10⁶cfu，轉化子重組效率為95.2%，擴增文庫達到109cfu?mL^-1。因此利用SMART技術可成功構建中國人肝組織cDNA酵母雙雜交文庫。

2、利用SMART技術可進行大鼠肺泡巨噬細胞酵母雙雜交文庫構建

有研究者構建了脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬細胞(AMs)酵母雙雜交cDNA文庫，探尋炎癥條件下與糖皮質激素受體(GR)相互作用的蛋白質分子^[2]。方法是用LPS和Dex作用于原代培養的肺泡巨噬細胞4h后，從肺泡巨噬細胞中提取總RNA，再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)為引物進行PCR擴增，得到兩端具有同源臂的雙鏈cDNA。后者純化后，與線性質粒pGADT7-Rec共轉化感受態酵母菌AH109，二者在酵母細胞中同源重組成環形的有復制活性的cDNA文庫質粒，收集在缺亮氨酸(Leu)培養板上篩選出所有克隆，即為AMs酵母雙雜交文庫菌。進而通過誘餌質粒pGBKT7-GR轉化構建成功的文庫菌，篩選與GR相互作用的蛋白分子。

結果構建了具有基因多樣性和庫容量足夠大的AMscDNA文庫，共獲得1.07×10⁶個轉化子，插入的雙鏈cDNA片段的長度在0.3~1.5kb之間。篩選文庫獲得1個真陽性克隆，經測序和同源性比較證實該克隆為BAG-1。研究發現利用SMART技術可成功構建肺泡巨噬細胞的酵母雙雜交cDNA文庫；GR與BAG-1在酵母細胞中存在著相互作用。

利用酵母雙雜交技術不僅可以發現新的蛋白質和發現蛋白質的新功能，以及建立基因組蛋白連鎖圖，還可以在細胞體內研究抗原和抗體相互作用。在新藥研發方面，酵母雙雜交技術還可以篩選藥物的作用位點以及藥物對蛋白質之間相互作用的影響。相信，在未來隨著科學技術的發展，酵母雙雜交技術的應用前景將會越來越廣闊。

[1] 利用SMART技術構建中國人肝組織cDNA酵母雙雜交文庫[J].

[2] 大鼠肺泡巨噬細胞酵母雙雜交cDNA文庫的構建與篩選[J].