內容摘要：樣品前處理 ①稱取樣品50 g于三角燒瓶中，加95%乙醇100 mI。，KOH 12 g，裝上冷凝管，于水浴(95℃)加熱回流3
h，取下三角燒瓶，樣液濾入裝有100 mI。水的分液漏斗中。 ②依次用乙醇50 mL、環己烷150 mL分兩次洗三角燒瓶，過濾后一并收于分液漏斗中，振搖3
rain，靜置分層，下層液放于第二只分液漏斗中，再用環己烷70 mI.提取3 rain，分層后，棄水層。 ③環己烷提取液合并于第一只分液漏斗中，用環己烷8
mI-，淋洗漏斗，洗液一并收入。用40℃100 mI。水洗環己烷提取液3次，水洗液合并于第二只分液漏斗中，用環己烷30 mI.提取1次，振搖1
min，分層后棄水層。再用40℃水50 mI。重復一次。 ④全部環己烷提取液經層析柱純化，用100 mL苯淋洗層析柱，流速2
mL/min。洗脫液用K—D濃縮器濃縮至0.1-10.5 mL，待檢。
苯并(a)芘殘留檢測
環境污染與食品加工(如煙熏、燒烤等)是造成食品中多環芳烴殘留的重要途徑。苯并(a)芘殘留檢測方法有乙酰化紙層析-熒光分光光度法和高效液相色譜法。
乙酰化紙層析一熒光分光光度法
l.原理
樣品經脫水后，用環己烷在脂肪抽提器中抽提，或經皂化后抽提;提取液經液一液分配后，再經柱層析純化、濃縮;濃縮液在乙酰化紙上點樣、展開、分離出的B(a)P在紫外光(波長365nm或波長254nm)下照射產生藍紫色熒光斑點，然后溶出熒光物質，用熒光分光光度計檢測其熒光強度(激發波長
386nm、發射波長405nm)，與標準比較定量。
2.儀器熒光分光光度計及紫外燈(波長365 nm)。
3.試劑
①環己烷(重蒸)。
②二氯甲烷(重蒸)。
③苯(重蒸)。
④醋酸酐。
⑤濃HzS04。
⑥KOH。
⑦無水NazS04。
⑧硅膠(60-1100目)。
⑨中性Al203(100~200目)，經130℃活化4h。
⑩B(a)P標準貯存液[100 ugB(a)P/mL]：準確稱取純品苯B(a)P10.omg，用環己烷溶解并定容至100mL。
?B(a)P標準溶液：1ugB(a)P/mL。
?乙酰化試紙的制備：將層析用濾紙裁成5cm×20cm紙條，浸入盛有300mL苯、260mL醋酸酐和0.2mI。濃H：SO。的層析缸中，不斷攪拌4h后，過夜，取出紙條在通風櫥內晾干，用蒸餾水洗2-13次晾干后，放人無水乙醇中浸泡4h，取出晾干壓平。
4.樣品前處理
①稱取樣品50g于三角燒瓶中，加95%乙醇100mI。，KOH12g，裝上冷凝管，于水浴(95℃)加熱回流3h，取下三角燒瓶，樣液濾入裝有100mI。水的分液漏斗中。
②依次用乙醇50mL、環己烷150mL分兩次洗三角燒瓶，過濾后一并收于分液漏斗中，振搖3rain，靜置分層，下層液放于第二只分液漏斗中，再用環己烷70mI.提取3rain，分層后，棄水層。
③環己烷提取液合并于第一只分液漏斗中，用環己烷8mI-，淋洗漏斗，洗液一并收入。用40℃100mI。水洗環己烷提取液3次，水洗液合并于第二只分液漏斗中，用環己烷30mI.提取1次，振搖1min，分層后棄水層。再用40℃水50mI。重復一次。
④全部環己烷提取液經層析柱純化，用100mL苯淋洗層析柱，流速2mL/min。洗脫液用K—D濃縮器濃縮至0.1-10.5mL，待檢。
5.紙層析
①點樣：在乙酰化濾紙一端5cm處，用鉛筆劃一橫線，用微量注射器吸取樣品濃縮液(10-150/uL)，同時點B(a)P標準溶液(1ug·mL-1)20uL。
②展開：將點樣后的乙酰化紙上端掛在圓柱形層析缸缸蓋的掛鉤上，層析缸內加30mL無水乙醇、5mI.二氯甲烷為展開劑，紙的下端浸入溶劑約lcm，在避光處展開，待展開劑前沿上升到距紙頂lcm時取出晾干。重復操作2~3次。
③紫外燈下照射：取展開后的乙酰化紙于紫外燈(波長365nm)下照射，用鉛筆圈出B(a)P標準點相應位置的熒光帶，用剪刀剪下圈內的這一部分，并剪成小碎片，放人具塞小試管中，準確加5mL苯，蓋緊后于60℃水浴加熱20min，在其間搖勻2次，冷卻待檢。
6.熒光測定
①定性分析：將檢測液移人石英杯中，置于熒光分光光度計上，調節儀器參數，將激發波長固定在386nm，對檢測液和標準液分別在發射波長400~500nm間掃描，繪出發射光譜圖(圖20—5)，再將發射波長固定在405nm，激發波長于250~400Flm間掃描，繪出激發光譜圖(圖20一6)。如兩者圖譜相同，就確認為苯并(a)芘。
②定量分析：將激發波長固定在38613.m，分別測定405nm、400nm、410nm處測定液和標準液的熒光強度，然后用基線法求出在405nm處的峰高值。
Y = I1/I0×Y0×1000/m
式中：Y——待檢液B(a)P含量，ug/kg;
Y0——標準液B(a)P含量，ug/kg;
I1——檢測液的熒光強度;
m——樣品質量，g。
7.說明
①熟肉制品試樣處理應先加水30mL和KOH12g，放置30min后再加乙醇100ml。
②用40℃溫水洗環己烷提取液時，第一次輕搖15次，第二次輕搖30次，最后振搖1min，避免劇烈振搖，防止乳化。
③層析柱下端放少量脫脂棉，先裝入10g硅膠，后裝3g中性A120。，裝時注意使裝好的柱中沒有氣泡。層析柱中也可填人硅鎂型吸附劑(60-1100目)。該試劑處理參照黃曲霉毒素檢測的高效液相色譜法。
④于脂肪提取器中放人脫脂藥棉，用環己烷浸泡，在水浴上經抽提4h以上，取出晾干。
⑤也可采用薄層層析法來檢測。在硅膠G薄層板上點不同系列標準液與待測液，然后用異辛烷展開3次，取出，在暗處稍晾干，置紫外光燈下(波長365nm)觀察，分別劃出所有熒光部分，再分別刮下后各加95%乙醇5mI。，振搖離心后，分別取上清液于熒光分光光度計下，用激發波長386nm檢測，標準系列根據熒光波長406nm處測得的峰高值，繪制標準曲線，樣液根據熒光波長406nm處的峰高值，從標準曲線查得苯并(a)芘的含量。
