高效液相色譜儀測定氨基酸的含量

　　1L--色氨酸含量的測定

　　1.1實驗儀器與試劑

　　色氨酸樣品，甲醇，STI501液相色譜儀梯度系統，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站，0.03%KH2PO4溶液

　　1.2HPLC色譜分析條件

　　流動相為0.03%KH2PO4溶液(A)-甲醇(B)，線性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱溫35℃，檢測波長276nm。

　　流動相時間(t/min)

　　5101520

　　A(%)80908070

　　B(%)20102030

　　1.3標準溶液的配制

　　精密稱取色氨酸標準標準品50mg，置100ml容量瓶中，振搖，用流動相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。

　　1.4標準直線的制作

　　精密稱取色氨酸標準樣品適量,分別稀釋制成每1ml中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg的溶液，注入液相色譜儀，以色氨酸峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，制作回歸標準直線。

　　1.5發酵液中樣品中色氨酸含量的測定

　　取發酵液，稀釋配制成約500μg/ml的溶液，搖勻，過濾，取25μl進樣，在高效液相色譜儀下測量，記錄峰值面積，作圖。

　　2L-精氨酸含量的測定

　　2.1實驗儀器與試劑

　　L-精氨酸標準樣品，乙腈，STI501液相色譜儀梯度系統，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站，磷酸二氫銨。

　　PH計，磷酸，

　　2.2HPLC色譜分析條件

　　流動相:以磷酸二氫銨溶液(稱取磷酸二氫銨1.15g,加水800m溶解后,用磷酸調節pH值至2.0±0.1,加水稀釋至1000ml)-乙腈為流動相，線性梯度淋洗;柱溫為30℃檢測波長為206nm;進樣量：25μl。

　　2.3標準直線的制作

　　精密稱取精氨酸標準標準品50mg，置100ml容量瓶中，振搖，用流動相溶解到刻度，作為供試品溶液，另取色氨酸樣品適量，同法操作。精密稱取精氨酸標準樣品適量,分別稀釋制成每1ml中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg的溶液，注入液相色譜儀，以精氨酸峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標，制作回歸標準直線。

　　2.4發酵液中樣品中精氨酸含量的測定

　　取發酵液，稀釋配制成約500μg/ml的溶液，搖勻，過濾，取25μl進樣，在高效液相色譜儀下測量，記錄峰值面積，作圖。

　　3L-甘氨酸含量的測定

　　3.1實驗儀器和試劑

　　乙酸銨溶液;乙腈;L-甘氨酸標準樣品;STI501液相色譜儀梯度系統，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站。

　　3.2HPLC色譜分析條件

　　流動相:A為0.02%mol/L乙酸銨溶液(PH=6.5):B為乙腈，線性梯度淋洗;流速:110mL/min;柱溫:30℃;進樣量:20μL。

　　梯度洗脫表3

　　流動相時間(t/min)

　　102030405060

　　A(%)806040406080

　　B(%)204060604020

　　3.3標準直線的制作

　　方法同2.2節

　　3.4發酵液中樣品中甘氨酸含量的測定

　　方法同2.5節

　　4L-甲硫氨酸含量的測定

　　4.1實驗儀器和試劑

　　L-甲硫氨酸標準樣品;甲醇;醋酸鈉;STI501液相色譜儀梯度系統，UV501紫外檢測器，7725I手動進樣閥，N2000色譜工作站。

　　4.2HPLC色譜分析條件

　　流動相:A為甲醇,B為50mmol/L的醋酸鈉緩沖溶液;流速1.0mL/min;梯度洗脫見表1，測定波長為262nm，柱溫為30℃。

　　梯度洗脫表4

　　流動相時間(t/min)

　　102030405060

　　A(%)30508085100100

　　B(%)7050201500

　　4.3標準直線的制作

　　方法同2.2節

　　4.4發酵液中樣品中甲硫氨酸含量的測定

　　方法同2.5節

　　5回收率實驗

　　稱取甘氨酸標準液50μg/ml分別稀釋0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按標準樣品處理方法，過濾，測定標準樣品中的甘氨酸的含量，計算回收率。