一、聚合酶鏈反應的歷史回顧
1、核酸體外擴增最早的設想
由 Khorana及其同事于1971年提出：“經過DNA變 性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重視該過程便可克隆tRNA基
因”。但由于當時很難進行測序和合成寡核苷酸引物，且當時(1970年)Smith等發現了
DNA限制性內切酶，使體外克隆基因成為可能，所以，使Khorana等的早期設想被人 們遺忘。
2、聚合酶鏈反應的發明
1985 年，美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等人才發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(Polymerase Chain
Reaction, PCR), 使人們夢寐以求的體外無限擴增核酸片段的愿望成為現實。其原理類似于DNA的體內
復制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。開始是使用大腸桿菌 DNA聚合酶Klenow片段來擴增人基因組中的特異片段。由于該酶不耐熱，因此，每次
加熱變性DNA后都要重新補加Klenow酶。在操作多份標本時，這一過程耗時，費力，
且易出錯。耐熱DNA聚合酶的應用使得PCR反應更易于自動化，繼而PE-Cetus公司推
出了第一臺PCR熱循環儀，使該技術的自動化成為現實。Mullis等因此項技術于1993年 獲得諾貝爾獎金。
二、聚合酶鏈反應相關技術的發展
PCR 及其相關技術的發展速度是驚人的。國際上分別于1988年和1990年在美國和
英國召開了第一屆和第二屆PCR技術專題研討會。第一屆會議主要討論了PCR的應用 與技術本身的優化問題;第二屆會議的主要議題是人類基因組計劃與PCR的最新進
展。這充分體現了生物學家對PCR的重視。
名 稱 主要用途
簡并引物擴增法 擴增未知基因片段
巢居PCR 提高PCR敏感性、特異性，分析突變
復合PCR 同時檢測多個突變或病原
反向PCR 擴增已知序列兩側的未知序列，致產物突變
單一特異引物PCR 擴增未知基因組DNA 單側引物PCR 通過已知序列擴增未知cDNA
錨定PCR 分析具備不同末端的序列
增效PCR 減少引物二聚體，提高PCR特異性
固著PCR 有利于產物的分離
膜結合PCR 去除污染的雜質或PCR產物殘留
表達盒PCR 產生合成或突變蛋白質的DNA片段
連接介導PCR DNA甲基化分析、突變和克隆等 RACE-PCR 擴增cDNA末端
定量PCR 定量mRNA或染色體基因
原位PCR 研究表達基因的細胞比例等
臆斷PCR 鑒定細菌或遺傳作用
通用引物PCR 擴增相關基因或檢測相關病原
信使擴增表型分型(mapping) 同時分析少量細胞的mRNA
三、其它擴增技術
與PCR及其相關技術發展的同時，新的擴增技術也不斷誕生。這些技術各有利 弊，與PCR互為補充，有的可結合應用，共同構成了核酸體外擴增技術的大家族。我
們相信，隨著分子生物學技術的發展，這一家族一定會再涌現出新成員。
技術 應用
轉錄依賴的擴增系統(TAS) 檢測HIV
連接酶鏈反應(LCR) 檢測點突變
自主序列復制(3SR)系統 研究RNA，臨床應用、法醫學等
鏈替代擴增(SDA) 檢測、鑒定基因
Qβ復制酶系統 增加探針檢測敏感性
循環探針反應 增加探針檢測敏感性
連接酶鏈反應 (A)
連接酶鏈反應(Ligase chain reaction，LCR),是一種新的DNA體外擴增和檢測
技術,主要用于點突變的研究及靶基因的擴增。是Backman 1997年為檢出靶基因序列 中的點突變而設計發明，并申報了專利。
LCR的基本原理為利用DNA連接酶。特異地將雙鏈DNA片段連接,經變性-退火-連 接三步驟反復循環,從而使靶基因序列大量擴增。
LCR 的擴增效率與PCR相當，用耐熱連接酶做LCR只用兩個溫度循環，94℃min變性
和65℃復性并連接，循環30次左右。其產物的檢測也較方便靈敏。目前該方法主要用 點突變的研究與檢測、微生物病原體的檢測及定向誘變等，還可用于單堿基遺傳病多
態性及單堿基遺傳病的產物診斷，微生物的種型鑒定，癌基因的點突變研究等。
依賴核酸序列的擴增 (A)
依賴核酸序列的擴增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)
，又稱自主序列復制系統(self-sustained sequence replication，3SR)或再生長
序列復制技術。1990年Guatelli等首先報道了這一技術。
NASBA主要用于RNA的擴增、檢測及測序。
其基本方法為：將引物,標本加入擴增反應液，65℃1min使RNA分子二級結構打
開,降溫至37℃加入逆轉錄酶,T7RNA聚合酶和RNase H,并在37℃反應1～1.5小時,其 產物經瓊脂糖電泳，溴乙錠染色即可在紫外儀下看到條帶。
NASBA的特點為操作簡便，不需特殊儀器，不需溫度循環。整個反應過程由三種 酶控制，循環次數少，忠實性高,其擴增效率高于PCR，特異性好。
轉錄依賴的擴增系統 (A)
轉錄依賴的擴增系統(Transcript-based amplification sytem，TAS)，是
Kwen等人于1989年研究報道的，主要用于擴增RNA。
TAS的主要特點是擴增效率高，因為其RNA拷貝數呈10的指數方式增加，只需6個
循環靶序列的拷貝數就能達到2×106。它的另一個特點是特異性高，由于TAS只能進行 6次溫度循環，錯摻率低，加之用葡聚糖珠夾心雜交，因而特異性也高。
雖然本法有較高的特異性和敏感性，但其循環過程復雜，需重復加入逆轉錄酶和 T7RNA多聚酶，有待進一步研究。
Qβ復制酶反應 (A)
Kacian 等于1972年首次報報Qβ復制酶(Q-beta replicase)催化RNA模板的自我
復制功能，它能在常溫30min，將其天然模板MDV-1RNA擴增至109。1986年Chu等報道
用生物標記的靶序列特異性探針，可與親和素聯接的MDV-1RNA雜交，經洗脫未被結合
的MDV-1后，再加入Qβ復制酶，擴增復制MDV-1拷貝，然后用溴乙錠染色檢測或用同 源性的第二探針雜交。
Qβ復制酶是一種RNA指導的RNA聚合酶，它有3個特點：①不需寡核苷酸引物的引
導就可啟動RNA的合成。②能特異地識別RNA基因中由于分子內堿基配對而形成的特有
的RNA折疊結構。③在Qβ復制酶的天然模板MDV-1 RNA的非折疊結構區插入一短的 核酸序列不影響該酶的復制。 因而，如在此區插入核酸探針，則其序列照樣可能被
Q β復制酶擴增。
1988年Lizardi等，將靶基因序列插進MDV-1質粒里，用T7RNA聚合酶催化轉錄
出MDV-1 RNA探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然后洗去非雜交的探針,加入Qβ 復制酶來擴增探針，被擴增的探針又可作為模板進行擴增，并呈指數遞增。其產物
按上述兩種方法進行檢測。現在該技術又發展了夾心雜交法，分子開關和靶依賴的復 制等技術。
四、PCR技術的應用舉例
研究：基因克隆;DNA測序;分析突變;基因重組與融合;鑒定與調控蛋白質結合DNA序列;轉座子插入位點的繪圖;檢測基因的修飾;合成基因的構建;構建克隆
或表達載體;檢測某基因的內切酶多態性
診斷：細菌(螺旋體、支原體、衣原體、分支桿菌、立克次氏體、白喉桿菌、致病大腸桿菌、痢疾桿菌、嗜水氣單胞菌和艱難梭菌等);病毒(HTLV、HIV、
HBV、 HPVS、EV、CMV、EBV、HSV，麻疹病毒、輪狀病毒、細小病毒B19);寄生蟲(瘧疾
等);人遺傳病(Lesh-Nyhan綜合癥、地貧、血友病、BMD、DMD、囊性纖維化等)
免疫學：HLA分裂;T細胞受體或抗體多樣化的定性;自身免疫病基因作圖;淋巴因子定量
人類基因組工程：用散布重復序列產生DNA標志;遺傳圖譜的構建(檢測DNA、 多態性或精子繪圖);物理圖譜的構建;測序，表達圖譜
法醫：犯罪現場標本分析;HLA-DQ
腫瘤：胰癌、結腸癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、血液惡性腫瘤
組織和群體生物學：遺傳聚類研究;動物保護研究;生態學;環境科學;實驗遺 傳學古生物學：考古與博物館標本分析
動物學：動物傳染病的診斷等
植物學：檢測植物病原等
