玫瑰花環試驗基本原理

　　基本原理

　　玫瑰花環試驗是體外檢測人和動物細胞免疫功能的一種方法。E—玫瑰花環試驗是T淋巴細胞計數的一種重要方法。由于人和動物的T淋巴細胞表面有紅細胞受體，因此紅細胞可以粘附到T淋巴細胞的周圍而形成玫瑰花樣的細胞團。在紅細胞中，以綿羊紅細胞最為常用。B淋巴細胞則沒有紅細胞受體，所以不能形成E—玫瑰花環，以資鑒別。

　　材料與試劑

　　1.肝素抗凝劑

　　2.淋巴細胞分層液 配制方法見細胞分離技術。

　　3.無Ca2+、Mg2+ Hank’s液 NaCl 4.00g NaHCO3 0.175g KCl 0.20g Na2HPO4.12H2O 0.076g KH2PO4 0.030g 葡萄糖 0.50g H2O加至 500.00ml 用5.6%NaHCO3調pH至7.2，115℃15min滅菌。4℃貯藏備用。

　　4.5.6%NaHCO3液 NaHCO3 5.60g H2O 100.00ml 115℃20min滅菌, 4℃貯藏備用。

　　5.0.8%戊二醛溶液 25%戊二醛溶液 0.32ml Hank’s液 9.68ml 用前配制。 6.Giemsa—weight染色液 Giemsa粉 0.03g Weight粉 0.30g 甲醇 100.00ml 先將染料一起放入研缽內，加入少量甲醇，研磨細，然后倒入瓶內，并用甲醇沖洗研缽內染料，一起倒入玻瓶內，補足甲醇量，備用。

　　操作方法

　　1.取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血漿(約1ml)。 2.于血漿中加Hank’s液數毫升，洗滌，1 500r/min離心5min～10min，棄上清。重復洗滌4次，沉淀均勻即為淋巴細胞懸液。 3.采綿羊肝素抗凝血，加數倍Hank’s液，洗滌3次，最后以Hank’s配成10%懸液，4℃保存。 4.取0.1ml淋巴細胞懸液，加10%紅血球懸液0.1ml，加小牛血清0.1ml。 5.37℃水浴10min，低速離心(600r/min)5min。 6.吸棄多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。 7.取出后，將沉淀輕輕搖起，加0.8%戊二醛0.1ml，混勻后4℃固定15min。 8.將干凈的玻片用Hank’s液沾濕，滴一小滴混懸液，讓其自然散開即可。 9.自然干燥后，用姬姆薩—瑞氏液(Giomsa—weight)或蘇木精—伊紅染色，水洗，干燥鏡檢。 結果判定 凡一個淋巴細胞結合3個或3個以上的紅細胞者為一個E—玫瑰環。檢查200個淋巴細胞，計算其玫瑰花環形成率。

　　注意事項

　　1.影響E—玫瑰花環試驗最主要的因素淋巴細胞和紅細胞的新鮮程度，被檢血樣必須新鮮，無菌，采血后要求在3h～4h內進行檢驗，否則由于淋巴細胞的死亡，受體脫落，影響檢查結果。紅細胞用阿氏液保存最多不要超過3周，且不應溶血。 2.控制好反應溫度、時間等條件對玫瑰花環形成率有較大影響。選37℃作用10min，低速離心5min，置4℃ 2h～4h，其結果穩定性較好，結合率較高。如在37℃作用時間較長，可見玫瑰花環發生變形，結合部位松弛、拉開，甚至解離。 3.指示紅血球的動物種類也與玫瑰花環的形成率有關。如馬淋巴細胞與豚鼠紅細胞結合較好，而驢則與綿羊紅血球結合較好。Melinda氏報道，人、馬、牛、豬、狗、貓、鼠與豚鼠紅細胞的結合率都高于綿羊紅細胞的結合率。 4.加犢牛血清能增加玫瑰花環形成細胞的穩定性，增強與指示紅細胞結合的牢固性。 5.Hank’s液的pH以7.2～7.4為宜。