紫外分光光度法----核酸的定量

　　原 理:

　　核酸的定量主要采用紫外分光光度法及電泳比較法。組成核酸分子的堿基，均具有一定的吸收紫外線特性，最大吸收值為250～270nm之間。例如腺嘌呤的最大紫外線吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鳥嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。這些堿基與戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不會改變，但核酸的最大吸收波長是260nm，吸收低谷在230nm，這個物理特性為測定核酸溶液度提供了基礎。在260nm波長紫外光下，1A值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml;單鏈DNA或RNA為40μg/ml;單鏈寡核苷酸為20μg/ml。可以由此計算核酸樣品的濃度(紫外分光光度法)。質粒DNA及微量DNA片段的濃度還可以通過與已知濃度的DNA標準同時進行電泳，根據其結合的溴乙錠熒光強度，估計其樣品的濃度(電泳法)。

　　操作步驟

　　(一)紫外分光光度法：

　　(二)瓊脂糖凝膠電泳比較法：若DNA樣品中含RNA或其它雜質，凝膠電泳是一種方便而較準確的定量方法。

　　1. 取2μlDNA樣品，加0.4μl電泳上樣緩沖液(含溴酚藍)，混勻后加樣于含0.5μg/ml溴乙錠的瓊脂糖微型電泳凝膠的孔格內。

　　2. 取一系列濃度不同的2μl標準DNA樣品(0.5～50μg/ml)0.4μl上樣緩沖液混合上樣。標準DNA溶液中，應含有一種與樣品DNA分子量大小相近似的DNA分子。

　　3. 電泳：使DNA移入瓊脂糖膠內。一般為溴酚藍遷移2cm左右。

　　4. 將凝膠浸入含0.01mol/L MgCl2的電泳緩沖液中5分鐘，進行背景脫色。

　　5. 在短波紫外線(254nm)下進行拍照，比較樣品DNA與DNA的標準品的熒光強度，并計算出待測樣品中DNA濃度。熒光法靈敏快速。但它的熒光強度決定于溴乙錠嵌入堿基中的多少，這與DNA的超螺旋程度密切相關，標準與樣品難以完全一致，并且還受其它影響熒光發光污染物的影響。

　　儀器與器材

　　1. 紫外分光光度計，微量石英比色皿

　　2. 電泳儀，電泳槽，紫外燈。

　　試 劑

　　1. 6×點樣緩沖液：0.25%溴酚蘭、40%蔗糖

　　2. DNA分子量標準：λDNA/HindⅢ

　　3. 50×TAE電泳緩沖液貯存液配方：(50×)每升 242g Tris， 57.1ml 冰醋酸， 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 1×緩沖液濃度：0.04mol/L Tris-HAc、0.002mol/L EDTA

　　4. 0.8%瓊脂糖凝膠：0.8g瓊脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解

　　5. 10mg/ml EB: 1.0g 溴乙錠 100ml 三蒸水