黑色素瘤小鼠腫瘤模型的建立及中藥治療研究

在腫瘤病因、發病機制研究和抗腫瘤藥物研發中使用小鼠腫瘤模型，能夠很好地復制人類疾病，也是腫瘤研究的主要途徑之一。黑色素瘤是常見的惡性腫瘤疾病，具有惡性程度高、病情發展快、預后差等特點，嚴重威脅著人們的生命健康。中醫在我國的醫療歷史上源遠流長，在黑色素治療上也取得了一些成就。中藥成分抗黑色素瘤作用具有多靶點、多環節、多效應的特點，其在抑制黑色素瘤血管生成、DNA的合成以及增強腫瘤轉移抑制基因的表達等方面有顯著作用。

目前小鼠腫瘤模型按照建立方式可分為自發和誘發小鼠模型、異種移植模型、轉基因小鼠模型、基因敲除小鼠模型、可調變的小鼠腫瘤模型5類。美迪西可以根據客戶的需求提供各種有效的動物模型，用來檢測藥物的有效性。實驗動物有非人類靈長動物、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、裸鼠等各種種類。目前，其已經建立多個有效動物腫瘤模型，并經過多方驗證和長期實踐考驗。在黑色素瘤的小鼠腫瘤模型的建立中，由于B16黑色素瘤是發生于C57BL/6小鼠耳根部的一種自發性腫瘤，因此是腫瘤研究的常用實驗模型之一。

1、黑色素瘤小鼠腫瘤模型的建立研究

為了快速有效地進行在體藥物篩選，研究了以小鼠黑色素實體瘤組織中的原代細胞構建黑色素瘤小鼠腫瘤模型的方法。黑色素瘤B16是 C57BL/6小鼠耳根部自發出現的腫瘤，將黑素瘤細胞通過皮下、靜脈或腹腔接種的形式注入受體小鼠體內可以構建相應的黑色素瘤動物模型。從荷黑色素瘤小鼠的組織中提取原代腫瘤細胞，與體外培養的B16細胞通過皮下注射分別植入兩組C57BL/6小鼠體內，考察兩組小鼠腫瘤顯現時間和生長速度。

結果表明當接種濃度為5.0×10⁶個/mL、每只0.2mL時，小鼠黑色素瘤原代細胞和體外培養的B16細胞成瘤率分別為100%和80%，且小鼠右前肢腫瘤(大小約4mm3)出現時間分別約在第3天和第8天。紫杉醇對兩種模型的初步評價顯示，與體外培養的B16細胞模型相比，原代B16細胞模型是體內篩選和評價特定化合物抗腫瘤活性的一種可行而有效的方法，成瘤時間較短、成瘤率高，所得實驗數據誤差也較小。小鼠腫瘤模型的建立為相關藥物評價模型的開發研究提供了一條可借鑒的新途徑。

目前世界范圍內癌癥最主要、最有效的治療方法是西醫的手術和放化療。但中醫中藥在治療癌癥中也同樣發揮著重要作用，對可根治的腫瘤，中醫可配合手術或放化療，能減輕治療的不適反應，增加治療的耐受性和有效性，提高患者生活質量。對不可治愈的腫瘤，中醫中藥可以作為一個重要的選擇方法發揮抗腫瘤作用。

2、中醫治療黑色素瘤動物模型的研究

（1）影響黑色素瘤腫瘤轉移相關基因的表達

對黑色素瘤肺轉移B16小鼠的研究中發現益氣敗毒湯組與環磷酰胺（CTX）組相比療效尚有差距，與生理鹽水組相比小鼠肺轉移的腫瘤數明顯減少，實驗證實CTX及益氣敗毒湯經胃管給藥治療后，小鼠肺腫瘤組織中腫瘤轉移抑制基因nm23的表達強度明顯增強，且組間nm23基因強度的表達差異無統計學意義。可見中藥制劑益氣敗毒湯可通過調控腫瘤轉移相關基因nm23影響黑色素瘤的轉移。

（2）中醫通過對免疫系統的影響來改善黑色素瘤

程序性死亡因子1/程序性死亡因子配體（PD－1/PD－Ls）通路的活化可抑制效應T細胞的細胞因子分泌以及增殖活化并促進T細胞的凋亡，進而引發抗腫瘤免疫的失活及腫瘤免疫逃逸。中藥黃芪多糖可抑制與免疫細胞活性負相關PD－1/PD－Ls通路以及減少免疫負性調控細胞調節性T細胞（Treg）的數目來抑制黑色素瘤的生長。負性調控細胞Treg可直接抑制T細胞的活化、增殖及相關免疫功能來影響腫瘤生長。在黃芪多糖調節黑色素瘤小鼠PD－1/PD－Ls分子表達的研究中證明黃芪多糖抑制共刺激分子PD－1/PD－Ls的表達，推測這種作用通過增強小鼠T淋巴細胞抗腫瘤免疫活性而抑制腫瘤的生長。

（3）對黑色素瘤血管生產的影響

三氧化二砷（As2O3）及白術內酯I抑制黑色素瘤的主要機制是抑制腫瘤中血管的生成。我國有研究者通過活體成像技術發現經三氧化二砷腹腔注射的小鼠黑色素瘤組織血管密度顯著降低，腫瘤組織中心發生壞死，抑制了腫瘤的生長及轉移，其抑制腫瘤血管的機制還需進一步研究。還有研究者通過實驗證實白術內酯I能夠顯著抑制血管內皮成管可能與其抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長有關。

（4）抑制黑色素瘤組織內細胞表達

基質金屬蛋白酶（MMPs）MMPs是一組Zn2+依賴性肽酶，可以降解多種細胞外基質和基底膜中的膠原成分，從而促進腫瘤侵襲轉移及血管生成，其中又以MMP－2和MMP－9研究較多。實驗證實人參皂苷Ｒg3能夠抑制小鼠黑色素瘤細胞表達MMP－9，使腫瘤的侵襲能力降低抑制黑色素瘤的轉移。我國有研究者在木鱉子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16細胞體內外侵襲轉移的實驗研究中證實木鱉子醇提物能下調B16細胞中MMP－2和MMP－9的mＲNA和蛋白水平，但不能降低金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP－1、TIMP－2）的表達。推測木鱉子醇提物抑制黑素瘤B16細胞侵襲的作用機制與其抑制MMP－2和MMP－9的表達有關。

在黑色素瘤動物實驗中，除了中藥，基因靶向治療和免疫研究也取得了一些進展，為其應用于臨床試驗奠定了基礎。在黑色素瘤小鼠腫瘤模型的研究上，首先要探索黑色素瘤侵襲轉移的分子生物關鍵機制，并尋找阻斷其發展的關鍵藥物；其次，實現黑色素瘤的早發現，早診斷，早治療，在此基礎上探索針對黑色素瘤早期的、敏感的、特異的診斷指標。最后，在藥物的聯合應用方面也值得深入研究，需要關注藥物的聯合應用是否進一步提高抗腫瘤效果。