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  • 原代細胞培養技術指南技術篇

    上一篇 / 下一篇  2012-07-22 15:06:12

      1、如何保持CO2培養箱中水盤的清潔?

      CO2 培養箱內底部一般配有一個水盤,用以維持CO2培養箱內的濕度。水盤內的水要定期更換和添加,水盤也要定期清洗以避免微生物的生長。為了減少微生物的污染,有一些CO2培養箱提供滅菌功能。有的可以加熱到比較高的溫度來滅菌,有的則通過讓空氣循環通過一個紫外線腔體的辦法來滅菌,這樣就滅菌時就不需要中斷細胞的培養。

      2、為什么放置在4oC冰箱中的原代細胞培養基會發生顏色變化?

      原代細胞培養基需保存4°C冰箱中。如原代細胞培養基中長生的CO2會逐漸溢出后,造成原代細胞培養基越來越偏堿性(pH大于7.4)。而原代細胞培養基中酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。原代細胞培養基偏堿后再用于細胞培養將造成原代細胞生長停滯或死亡。原代細胞培養基如偏堿時,可以通入無菌過濾的CO2,以調整pH值。

      用新鮮的原代細胞培養基進行細胞培養。

      3、購置的血清一定要進行滅活處理嗎?

      血清滅活處理對大多數的原代細胞培養并非必需的。

      高溫滅活處理的血清可能帶來的問題:

      (1)影響血清的質量,此血清造成原代細胞生長速率的降低。

      (2)沉淀物的形成增多,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察時像是“小黑點”,常會誤為是原代細胞培養污染。

      高溫滅活處理的血清放在37°C環境中,沉淀物增多,此非微生物的分裂擴增。

      購置高質量、好品牌的血清,無需滅活處理。

      4、血清最好的保存方法是什么?

      500ml血清需分裝保存。

      血清長期保存需放置在-20°C。

      血清在4℃保存時,請勿超過一個月。

      500ml血清分裝為每50ml/管,-20°C保存。

      5、凍存的血清如何解凍?

      血清從冷凍箱取出,放置4°C處24小時,然后放置室溫至全融。

      凍存血清融解過程中,必須規則地搖晃均勻。

      6、為什么解凍血清后有絮狀沉淀物出現?如何處理和避免?

      解凍血清后有絮狀沉淀物并不影響血清本身的質量。

      解凍血清后有絮狀沉淀物出現主要原因:

      (1)血清中脂蛋白的變性所造成;

      (2)血纖維蛋白存在于血清中;

      處理和避免解凍血清后有絮狀沉淀物出現:

      (1)解凍后血清離心至絮狀物沉淀,上清液過濾;

      (2)解凍后血清切勿直接過濾;

      (3)解凍步驟:-20°C~4°C室溫;

      (4)熱滅活血清易造成沉淀物增多,多無須此步驟。

      (5)熱滅活血清原則:56°C、30分鐘、搖晃均勻。

      凍存血清融解過程或熱滅活時,必須規則地搖晃均勻。

      7、為什么原代細胞培養生長減慢?

      原代細胞培養生長減慢原因:

      (1)原代細胞培養基和添加基的配置或選購不當;

      (2)胎牛血清質量不高或保存不當;

      (3)缺乏或已被破壞細胞生長必需成分:如谷氨酰胺、生長因子;

      (4)細菌或真菌等微生物污染;

      (5)培養條件不正確如溫度、濕度、CO2濃度;

      原代細胞培養體系、微生物污染、培養條件三種因素。

      8、細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎?

      不見得!因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下pH8.0、溫度37°C其作用能力最強。另外,鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液沖洗細胞培養瓶,以便于將含血清的培養基沖洗干凈,這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為:

      (1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;

      (2)0.25% 胰蛋白酶

      多數細胞傳代消化可使用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA這種消化液。

      9、為什么原代細胞冷凍管經解凍后會發現細胞數目減少或太少?

      原代細胞冷凍管經解凍后,再離心是造成細胞數目減少或太少的主要原因。

      原代細胞解凍后不要立刻離心。

      10、為什么原代細胞培養時需使用5%CO2或10%CO2?

      原代細胞培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。

      原代細胞培養基使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統。

      當原代細胞培養基中NaHCO3含量為每公升1.5g時,原代細胞細胞培養時應使用5%CO2。

      當原代細胞培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時,原代細胞細胞培養時應使用10%CO2。

      原代細胞培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,原代細胞細胞培養時應使用5%CO2。

      11、原代細胞培養解凍培養時如何去除DMSO?

      除少數原代細胞對DMSO敏感之外,絕大部分原代細胞培養,在解凍之后,應直接放入含有10-15ml新鮮原代細胞培養基中,隔日再換新鮮原代細胞培養基去除DMSO。

      隔日換新鮮原代細胞培養基時,去除DMSO。

      12、原代細胞培養出現死亡常見原因有什么?

      (1)培養箱內CO2濃度;

      (2)培養箱內溫度穩定;

      (3)培養箱內溫度濕度;

      (4)細胞凍存過程;

      (5)細胞復蘇過程;

      (6)原代細胞基礎培養基;

      (7)原代細胞培養添加劑;

      (8)血清的質量;

      (9)操作人員技術;

      原代細胞基礎培養基和原代細胞培養添加劑尤為重要。

      13、L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?

      L-谷氨酰胺作為培養細胞的能量來源,參與蛋白質的合成和核酸代謝。

      L-谷氨酰胺降解率隨保存溫度而變。細胞生物學技術服務

      L-谷氨酰胺降解致氨形成,氨對細胞具有毒性作用。

      使用新鮮的L-谷氨酰胺。

      14、原代細胞基礎培養基及原代細胞培養添加物可反復凍融嗎?炎癥檢測技術服務

      原代細胞基礎培養基不要凍融,放置4°C保存。

      原代細胞培養添加物最多可以凍融3次。

      15、原代細胞培養體系中添加了血清和抗生素后,可長期保存嗎?

      原代細胞培養體系中添加了血清和抗生素后,放置4°C保存可使用3-4周。

      使用小包裝(250ml或100ml)的原代細胞培養體系。

      16、如何處理原代細胞支原體污染?

      (1)直接對培養原代細胞滅菌后丟棄;

      (2)清潔環境;

      (3)重新評估原代細胞培養體系的無菌;

      (4)重新評估原代細胞培養無菌操作技術;

      17、原代細胞冷凍保存應用DMSO的注意事項有哪些?

      Sigma D2650 Tissue culture grade用于原代細胞冷凍保存。

      DMSO為無菌狀況。

      DMSO第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于4°C,避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質,并可減少污染之機會。

      DMSO要過濾,須使用耐DMSO的Nylon濾膜。

      原代細胞培養時,需購置原裝Sigma的DMSO。


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