鏈霉菌原生質體的轉化
1. 將最多5 ul的DNA(質粒或酶連產物)加于已經裝有50 ul原生質體的指型管(1.5 ml)的管壁上(不與原生質體接觸)。
2. 吸取200ul的25% PEG4000(PEG應先滅菌，再用P Buffer配置)，將DNA沖入原生質體中，小心抽吸幾次使之混勻。
3. 將混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。
4. 30度培養14~20 hr后(待原生質體再生后，即平板呈霧狀)，用含有適當抗生素的1 ml無菌水溶液覆蓋。
5. 再培養1~2 d后，可以看到小的轉化子菌落長出。
PCR-Targeting技術中E.coli電轉化感受態的制備及電轉化
1. 將天藍色鏈霉菌庫斯質粒轉化進入大腸桿菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規的CaCl2
法。(pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的復制區，培養時溫度要嚴格控制在30゜C以下)
2. 培養含庫斯質粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸桿菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml
Amp的SOB-MgSO4 (不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM )中，30゜C搖床培養過夜。
3. 取一部分過夜培養物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養基(含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp)中，菌體終濃度為1%
，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導λ/red 重組系統。
4. 30゜C ，200rpm搖床培養3-5h 至OD600~0.6 。
5. 將培養物倒入預冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細胞溫度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C離心 5min。
6. 棄掉上清，加1ml預冷的10%甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10%甘油,搖勻。
7. 4000rpm 4゜C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重復上面操作：4000rpm
4゜C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細胞打散。(感受態細胞濃度越高電轉效果越好)
8. 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50ul感受態細胞與1-2ul
PCR產物(經純化，可盡量濃，但不能加得過多)，混勻后立即電擊，電擊條件：200Ω,25uF,2.5kv, 電擊結果為4.5~4.9ms
較理想。(電轉化杯在70%乙醇中保存，用前先在無菌環境下用無水乙醇洗一下，再吹干，放冰上預冷，無水乙醇能加快吹干的速度。也可以選擇0.1cm的電轉化杯，但電擊的參數就得變為：1.8
kV，?Ω,?uF)
9. 立即加1ml預冷的SOC，37゜C誘導培養40min(如需在同一庫斯質粒上中斷基因，則30゜C誘導培養)。
10. 涂LA(含100ug/ml
Amp及與電轉片段攜帶的抗性標記相應的抗生素)平板，37゜C過夜培養。(轉化子中含有兩種質粒，分別是重組前和重組后的質粒，所以要抽質粒再轉化一次
DH5?)
