基于細胞毒性的抗體類生物治療藥物活性測試方法

抗體類藥物是指含有抗體基因片段的蛋白藥物，它與靶抗原結合的特異性、安全性和有效性等特點，使其在臨床上的一些重大疾病中取得了快速的發展。在研究抗體藥物如何影響人體之前，需要先考察藥物對細胞內部的影響，基于細胞毒性的抗體類生物治療藥物活性測試方法，為抗體藥物的研發和質量控制提供了方向。

生物技術藥物活性測試在質量控制中至關重要，目前的生物活性分析方法主要包括體內(動物)和體外(細胞)實驗。上海美迪西的生物部在體外生物學領域有豐富廣泛的經驗，通過酶水平測定、細胞水平測定、細胞生物學、生物化學、體外同位素測定、穩定細胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技術等，提供一套完整的生物學服務。

藥品質量應該在基于對藥物分子生物學特性、作用機制全面了解的前提下，設計開發相應的生產工藝，以求藥物分子達到其預期的質量屬性。雖然生產過程結束后的產品質量分析是藥品質量控制中的重要組成部分，但這些檢測不應是單純的揭示其生產過程的結果，而是對藥品的預期屬性進行確認。藥物分子進入到細胞內，結合細胞內的靶點，從而產生藥理作用。在藥物研究中，靶標暴露不足是導致藥物高損耗的主要原因。假設細胞靶點暴露不足會導致較低的“藥物效率”。靶點暴露不足導致藥物實驗中的高消耗率，是臨床藥物開發失敗的重要因素。

細胞毒性是由細胞或者化學物質引起的單純的細胞殺傷事件，不依賴于凋亡或壞死的細胞死亡機理。有時需要進行特定物質細胞毒性的檢測，比如通過藥物活性測試來進行篩選藥物。細胞毒性檢測主要是根據細胞膜通透性發生改變來進行的檢測，常用MTT、XTT法，利用線粒體內部酶的活性，可以將特定的四唑鹽類進行轉化，然后通過酶標儀進行檢測。

細胞凋亡有兩條途徑，一是線粒體依賴途徑，另一個為死亡受體介導途徑。腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α)和受體結合后，可啟動死亡受體介導途徑，使procaspe-8自我水解、活化，形成活性caspase-8，后者再激活caspase3、6、7等，引起下面的級聯反應，導致細胞發生凋亡。重組人II型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白的活性測定可以利用其能夠抑制TNF-α所引起的敏感細胞系U-937中caspase3/7活化。

1、通過檢測細胞培養上清中LDH的酶活性，進行抗體類生物治療藥物活性測試

LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩定的蛋白質，存在于正常細胞的胞質中，一旦細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸鹽，和INT（四唑鹽類）反應形成紫色的結晶物質，可通過500nm酶標儀進行檢測。通過檢測細胞培養上清中LDH的活性，可判斷細胞受損的程度。

2、通過螢光素酶發光信號的改變來進行藥物活性測試

通過Caspase-Glo3/7檢測試劑盒中螢光素酶發光信號的改變來反映該制品的活性。此外，針對TNF-α的單抗還可以采用對TNF-α殺傷敏感的細胞系，如小鼠成纖維細胞L929、小鼠纖維肉瘤細胞WEHI164等，抗體能夠抑制TNF-α所誘導的細胞凋亡作用，通過檢測細胞存活的染色來評價抗體的生物學活性。在細胞存活相關染料的選擇上，包括結晶紫、MTT、MTS、CCK-8等在內的染料具有各自的優缺點。

3、其它酶方法
（1）結晶紫

結晶紫是一種三苯甲烷類染料，常用作生物染色劑和無機離子的顯色劑。其染色過程雖然相對簡單，但是不能區分死活細胞，只能反映細胞數量。

（2）MTT

而MTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水不溶性的橙黃色甲臜產物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能，因此可間接反映活細胞數量，但MTT還原產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。

（3）MTS

MTS還原產物是水溶性的甲臜，無需洗滌和溶解步驟，使用更方便，重復性優于MTT。而CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中，溶液相當穩定，對細胞沒有毒性，可長時間孵育，是用于測定細胞毒性或細胞增殖試驗中活細胞數目的一種簡便快速、靈敏度高、重復性好的染料。

隨著生物技術的不斷進步、人類后基因組學和代謝組學的到來，越來越多的新靶點被發現和研究，擴大了抗體所針對的抗原范圍，也必將擴大抗體藥物的市場。也會有越來越多的新型技術用于單抗藥物活性測試，以實現對抗體藥物進行精準、多方位、動態的分析，為抗體藥物的質量提供了新的保障。