質譜在生物醫藥中的應用

　　回顧質譜百年發展歷史，從英國物理學家Joseph John Thomson研制出世界上第一臺質譜儀，到現在復雜的Orbitraps，近一百年來質譜的發展非常迅速，質譜技術的開發也越來越偏重于應用。從質譜在Nobel上的獲獎情況來看(1906年Thomson獲Nobel物理學獎;1922年Aston因同位素模式獲 Nobel化學獎;1939年Lawrence因回旋共振獲Nobel物理學獎;1989年Wolfgang Paul因離子阱獲Nobel物理學獎;2002年John Fenn和田中耕一因離子源獲Nobel化學獎)，鄧教授認為下一個質譜方面的Nobel獎可能會是傅立葉變換在質譜儀上的應用。傅立葉變換是一個非常重要的工具，通過傅立葉變換可以把時域信號轉化為頻率，通過頻率和質量的關系，我們就能得到高精確度的質譜圖。根據文獻(Mann and Kelleher PANS November 25,2008 vol. 105 No. 47 18135)對比，低分辨離子阱/四極桿/三重四極桿的精確度是1-0.1Da，中等分辨的飛行時間/Q-TOF的精確度為0.1-0.01Da，而高分辨的FTICR MS/FT-Orbitrap這類傅立葉質譜儀的精確度高達0.01-0.001Da。更高的分辨將提高蛋白質組學鑒定的確信度，并能夠檢測多種變化、翻譯后修飾等。

　　鄧教授援引Nature上的一篇提為《2020 visions》的文章，其中提到在以后十年里比較有前途的兩個領域是代謝組學和微生物組學。廣義的代謝組學可分為很多小的領域，如糖的代謝組學、脂質組學等。目前科學家們還建立了代謝組學的數據庫，如Scripps代謝組學中心建立的METLIN數據庫，和Human Metabolome Database。代謝產物檢測的流程并不復雜(比蛋白質組學稍微簡單一些)，一般為生物化學萃取-樣品制備-LC-MS(+)或LC-MS(-)/GC-MS-鑒定-定量-解釋，難點集中在最后兩個步驟，要借助一些軟件。

　　比較《Sarcosine levels in prostate cancer and its association with cell invasion》(A Sreekumar el al. Nature 457, 910-914, 2009)，把癌癥病人分為兩組，一組是癌細胞還未擴散的病人，一組是已經擴散的惡性病人，進行代謝組學分析。鑒定出1000余種小分子，并發現其中有6 種小分子表達濃度在癌癥病人(尤其是惡性癌癥病人)中比正常人高很多，比如肌氨酸(sarcosine)。研究者還在細胞中添加了sarcosine，發現會增加細胞的movement擴散度(雖然很多人認為這不是一個非常好的證明方法)。研究者還解釋了這個小分子發生作用的機理，并指出了一種甲基化酶，把一個甲基放在了glysine上，就變成了sarcosine;而有了酶，就有了一個藥物靶向分子。這是一個非常好的例子，通過代謝組學研究，可以發現生物標志物。當然，正如蛋白質組學研究一樣，接下來的幾年尚無法證實發現的這個sarcosine小分子是非常特異的生物標志物。目前也有種觀點倡導系統生物學研究，即認為真正起作用的生物標志物可能是包含小分子、大分子等的一組物質，來協同起作用。

　　接下來，鄧教授介紹了在結核病新藥研發方面的研究，結核病(TB)是一種古老的傳染病，由結核桿菌感染引起，占世界三分之一的人口感染了結核桿菌。多種耐藥性結核病菌、HIV/TB雙重感染、治療時間長、存在潛伏期，這都是目前結核病治療面臨的挑戰。鄧教授分別介紹了他們利用代謝組學研究，來篩選新型結核病藥物。比如發現了三種小分子：OPB、FAD、FMN。然后用質譜法來做代謝組學研究，并解釋了其作用的機理。鄧教授還介紹了一種方法來鑒定所有的藥物相關的代謝物。在該藥物的代謝組學研究中，用質譜做代謝譜(profiling)得到5,000~6,000種小分子，即使送到所有數據庫大部分也得不到結果，但毫無疑問，這其中一定有些分子是和藥物有關的，鄧教授介紹了一種最常用的方法，即改變藥物分子(比如用D取代藥物分子中的H)，如果產生的代謝產物中有藥物分子，比較用原來的藥物產生的代謝產物分子和D代藥物產生的代謝產物，會發現有些化合物有分子量的區別，通過這種代謝譜分析(Metabolic Profiling)，就可鑒定出所有與藥物有關的代謝物，并且推斷藥物的作用機理。

　　只是鑒定所有的代謝產物是不夠的，如果要建立一個所有代謝的代謝途徑，就要進行Flux分析(代謝通量分析)。Flux分析在人身上是做不了的，一般都是在E. Coli(或yeast)上做的。用穩定同位素標記E. Coli，然后進行代謝，在不同的時間提取代謝產物進行色譜-質譜分析，看看代謝產物的變化。比較有影響的一篇文章是《Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy》(Nature Biotechnology 26, 1179, 2008) ，它對人巨細胞病毒human cytomegalovirus (HCMV)進行了Flux代謝通量分析。用13C標記的葡萄糖和谷氨酰胺來喂養哺乳動物細胞并進行動力學監測。感染HCMV的代謝通量通過包括糖解的多數中央碳代謝途徑顯著上調，特別是通過三羧酸循環和其流出到脂肪酸生物合成途徑中顯著地增加。而抑制脂肪酸生物合成的藥理抑制劑抑制了HCMV和A型流感的復制。通過該實驗，不僅了解了代謝產物的變化，而且可鑒定一些新的藥物靶分子。

　　除了代謝組學外，還需要考慮如何從組學到基因功能。這里介紹了一些合成的小分子來作為探針(Activity-based Chemical Probes)，可以和酶的活性位點反應。利用這些探針，可以檢測到酶到底在什么位置。接下來，介紹了Cravatt去年發表在Cell上的文章《Monoacylglycerol lipase regulates a fatty acid network that promotes cancer pathogenesis》(Cell. 140, 49-61. 2010)。

　　談到生物醫學中質譜將來的作用，鄧教授談了幾點。由于質譜具有高特異性，目前更有很多高分辨率的質譜，所以對“其它技術可能取代質譜”的擔憂是不必要的。而且相對于結構生物學和單分子分析，質譜的優點還在于可以分析混合物。談到未來的質譜發展，鄧教授認為，十年前我們認為我們可以做蛋白質組，現在的結論是我們只能做一部分蛋白質組，所以和基因組/基因測序的差距還很大。未來十年二十年，希望能出現一種全新的質譜，可以像基因測序儀那樣應用。

　　來自軍事醫學科學院的謝劍煒研究員做了題為《芥子氣暴露的確證》的報告。首先謝研究員介紹了芥子氣暴露的確證研究的背景。

　　芥子氣(HD)是一種糜爛性化學毒劑，曾多次應用于戰爭中，造成大量人員傷亡，二戰期間侵華日軍就曾經在中國各地遺棄可大量化學武器，對周邊地區人民構成了巨大威脅。芥子氣具有復雜的生物學作用機制，可與人體內的核酸、蛋白質、酶作用，使得細胞的代謝和功能發生障礙，導致變性、炎癥和壞死。因此芥子氣暴露確證技術的研究非常重要。

　　芥子氣是一種雙功能烴化劑，在生理條件下極容易發生親電反應。目前，對于芥子氣暴露確證技術的研究的難點主要集中在以下幾點：

　　(1)毒理機制尚不十分明確;(2)暴露后有潛伏期，不能及時診斷;(3)癥狀與燒傷、化學傷類似;(4)靶器官廣泛，無特效解毒藥。

　　生物標志物是生物體內污染物暴露劑量和生物效應的指示劑。在毒物風險評估、暴露確證、疾病預警、防治效果評價等方面起著重要作用。生物標志物檢測方法的研究是芥子氣中毒或暴露確證的基礎，對芥子氣中毒的臨床快速診斷，中毒程度的評估以及針對性的醫療救治具有重要意義。

　　芥子氣在生物體內的主要代謝途徑包括水解氧化、與蛋白質加合、與DNA加合、以及與谷胱甘肽加合后經β-裂解酶裂解形成一系列的化合物等。芥子氣的生物標志物類型包括：原型、代謝物、DNA/蛋白加合物。生物標志物如果是原型，則迅速反應;如果是代謝物，存在時間也較短(數日);如果是DNA/蛋白質加合物，可以存在幾周到幾個月的時間，這就更有利于核查員到當地的檢測(比如如何指正幾個月前曾制造過芥子氣的地點)。

　　接下來，謝研究員詳細介紹了他們實驗室在這方面所做的研究。研究思路為：合成純化相關生物標志物參考品(含同位素標記參考品)，然后建立溯源性技術方法(色譜-質譜聯用技術，方法遵循FDA生物分析方法認證的要求)，再研究染毒動物模型的時量效關系，并從體外實驗，到體內，再到診斷治療。目前，其課題組已經分別建立了芥子氣暴露后的DNA-加合物、蛋白質加合物、水解和代謝產物的高靈敏度、高選擇性質譜分析技術方法：

　　(1)DNA加合物是由具有親電集團的化合物或其體內代謝產物與DNA共價鍵合所形成的化合物，是DNA化學損傷最重要和最普遍的形式。謝研究員課題組通過大鼠的體內外染毒實驗-提取DNA-水解DNA-超高壓液相色譜-三重四極桿離子阱串聯質譜技術，揭示了N7-HETEG、O6-HETEG、Bis-G、N3-HETEA等四種DNA加合物在生物體內的分布及代謝過程，從分子水平研究HD- DNA加合物與暴露劑量、損傷效應之間的聯系，為HD毒理機制的深入研究提供了技術基礎;其中1-21天取血樣和組織樣可檢測DNA加合物N7- HETEG，并可作為生物標志物。

　　(2)采用LC-MS/MS方法，進行HD-蛋白質加合物位點的篩選與評價。芥子氣與血液中豐度較高的蛋白(珠蛋白和HSA)均可發生多位點共價反應。包括球蛋白的17條肽段，HSA的24條肽段以及球蛋白的N-端V殘基、HSA的Q殘基，另外還有16中氨基酸殘基。謝研究員分別介紹了芥子氣與Glu殘基、 Cys殘基、HSA肽段、珠蛋白間的加合反應及其加合位點。然后設計了技術路線：HD和/或HD-d4染毒全血-取紅細胞后提取蛋白-加入珠蛋白后進行 Edman降解-SPE萃取后衍生化-通過同位素稀釋-GC-MS(NCI)方法檢測體外染毒(芥子氣暴露)人全血樣中的HETE-Val狀況，并與家兔體外染毒情況進行了比對。結果表明N-HETE-Val可作為芥子氣中毒潛伏期(染毒后15分鐘)以及中毒癥狀消失后(103天)的診斷生物標志物和溯源性檢測生物標志物。

　　(3)用同位素稀釋-GC-MS檢測尿樣中的TDG和TDGO，并與家兔染毒情況進行了比對。

　　(4)通過家兔皮膚染毒實驗，發現芥子氣中毒體內谷胱甘肽加合物β-裂解產物的溯源性核查時間長達28天。對于各染毒劑量組，β-裂解產物的排出量均在前 2天的尿樣中較高，3天后排出量就比較少。一周內排出總量的99%以上。結果表明β-裂解產物還原產物SBMTE因其在染毒后一段時間內存在高濃度水平，且體內無內源性物質存在，是確證芥子氣暴露生物標志物之一;1-4天取血漿樣，1-28天取尿樣。