熒光顯微鏡的使用及注意事項

　　一、熒光顯微鏡標本制作要求

　　1.載玻片載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

　　2.蓋玻片蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干澀蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本。

　　3.標本組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能被充分激發。另外，細胞重疊或雜質掩蓋，影響判斷。

　　4.封裱劑封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在PH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L PH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

　　5.鏡油一般用暗視野熒光顯微鏡和油鏡觀察標本時，必須使用鏡油。最好使用特制的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。

　　二、熒光顯微鏡基本操作

　　1. 關閉房間內的電燈，開啟顯微鏡汞燈; 2.根據樣品標記的熒光素選擇相應的濾光片; 3.放好樣品，找到合適的視野; 4.如需拍照，請確認照相機內已裝好彩色膠卷(最好使用27定膠卷); 5.開啟自拍裝置，選擇手動檔，通常拍攝速度在0.5-10秒內; 6.使用結束，關閉所有電源并做好使用記錄。

　　三、熒光圖像的記錄方法熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片即可。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。

　　四、使用熒光顯微鏡的注意事項

　　1.嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

　　2.應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。

　　3.防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

　　4.檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過2～3h。

　　5.熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。

　　6.標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

　　7.熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”指無或可見微弱熒光。“+”指僅能見明確可見的熒光。“++”指可見有明亮的熒光。“+++”指可見耀眼的熒光。