淺析蛋白質組學樣品的制備

蛋白質組學是指研究細胞、組織或生物體蛋白質組的組成及其變化規律的科學，目前蛋白質組學研究正日益成為現代生物學中的研究熱點。蛋白質組學技術服務結合基因組學、代謝學等生命組學研究技術，來挖掘多層次分子信息，同時應用現代遺傳技術、分子影像技術、生物信息技術，結合患者生活環境和臨床數據，可以實現精準的疾病分類和診斷，制定出具有個性化的疾病預防和診療方案。因此蛋白質組學不僅在早期診斷方面，還在在疾病預防、分型、療效監測、判斷預后等諸多方面都有著巨大的潛力。

蛋白質組樣品的制備是蛋白質組學研究的基本技術之一，也是蛋白質組學研究的首要步驟，該技術要求盡可能完整地將所有的蛋白質從細胞或者組織中提取出來。蛋白質學樣品制備的基本原則是：

1、蛋白質學樣品制備的基本原則

（1）樣品處理盡量簡單，減少蛋白損失；

（2）盡量避免蛋白的降解；

（3）盡可能提高樣品蛋白的溶解度；

（4）防止溶液介質中對蛋白質的人為修飾；

（5）去除非蛋白雜質。

2、制備過程

蛋白質的制備一般要經過4個階段：選擇材料和預處理，材料的破碎，提取和純化，濃縮、干燥和保存。由于蛋白種類繁多，性質差異較大，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。根據性質進行分類，大部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質。

3、制備原理

蛋白質在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的內因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。

（1）溫度

多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。

（2）pH值

蛋白質、酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。

（3）離子強度

稀濃度可促進蛋白質的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量 NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾為宜，緩沖液常會采用 0.02-0.05M 磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。提取蛋白質時常根據這些內外因素綜合加以利用，將細胞內蛋白質提取出來，并與其它不需要的物質分開。

4、制備方法

破碎的方法有許多種，可歸納為：

（1）機械法（超聲波法、機械勻漿法、液氮研磨法和玻璃珠破碎法）；

（2）化學法（去污劑法、酶裂解法）；

（3）物理法（循環凍融法、滲透法、高壓法）。

這些方法有不同的應用范圍，基本的原則都是要以最小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解變性，這也就是在樣品制備破碎這一步的關鍵所在。而常用的方法有：超聲波法、機械勻漿法、液氮研磨法、鹽析、沉淀法。其中，有機溶劑沉淀法使用較為普遍，常用的有機溶劑有丙酮、苯酚等。

有機溶劑沉淀法的優缺點

    優點：

（1）分辨能力高，即一種蛋白質或其他溶質只有在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉淀；

（2）根據實驗要求選擇最合適的溶劑可以使實驗盡可能準確；

（3）成本較低。

缺點：容易引起蛋白質變性失活，操作常需在低溫下進行。且有機溶劑易燃、易爆、安全要求較高。

冷丙酮沉淀和苯酚提取方法的優缺點

丙酮和苯酚沉淀法注意事項：

冷丙酮沉淀

（1）冷丙酮沉淀的時間與溫度；

常溫或升溫時，蛋白立體結構展開，丙酮極容易與其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸進行疏水結合導致蛋白變性，所以我們通常預冷丙酮并且低溫操作；

（2）超聲功率和時間，重在觀察超聲后樣品溶性的均勻度；

（3）一般和三氯乙酸一起使用，效果更好；

（4）還原烷基化。

苯酚提取

（1）各種試劑的正確及精確配制（如：煎糖提取液）；

（2）加入飽和酚后要充分震蕩和離心（使蛋白充分與酚、色素H鍵結合，讓其分三層）；

（3）需純化蛋白（甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等雜質）。

美迪西的蛋白質組學技術服務整合了生物化學、細胞生物學、分子生物學與質譜等多項技術，能夠實現蛋白鑒定、差異蛋白定量分析、復合物分離、蛋白翻譯后修飾（如：磷酸化、糖基化、泛素化等）的解析及蛋白質組信息學分析。