旭月活體研究通訊

通告：今日起，原“imOmics精華速遞”改版為“旭月活體研究通訊”，簡稱“旭月通訊”，每周一期。除介紹最新的NMT文獻外，還有實驗設計、設備操作、數據分析、文章撰寫、審稿答疑......更多干貨，等你來撩。

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NISC文獻編號：C2015-036

研究使用設備

NMT活體生理檢測儀 NMT  Physiolyzer^?

硝酸鹽是谷類作物主要的氮源，因此掌握谷物的硝酸鹽信號轉導對于提高其氮利用效率至關重要。盡管已經在擬南芥中鑒定出了幾個硝酸鹽信號轉導的調節因子，但在谷物中并未發現。

中國科學院遺傳與發育生物學研究所童依平課題組在Plant Physiology上發表了一篇文章，題為“The Nitrate-Inducible NAC Transcription Factor TaNAC2-5A ControlsNitrate Response and Increases Wheat Yield”，主要探究谷物中硝酸鹽轉運反應。

野生型與過表達型玉米，在高低氮條件下根部NO₃^-流檢測。正值表示吸收。

課題組從小麥中分離到一種硝基誘導的谷類特異NAM，ATAF和CUC(NAC)轉錄因子TaNAC2-5A。染色質免疫沉淀試驗表明：TaNAC2-5A可直接與硝酸鹽轉運蛋白和谷氨酰胺合成酶編碼基因的啟動子區域結合。小麥中TaNAC2-5A過表達促進根的生長以及硝酸鹽吸收速率，從而提高根系吸收氮素的能力。

研究利用基于非損傷微測技術（Non-invasive Micro-testTechnology, NMT）的NMT活體生理檢測儀 Physiolyzer?，檢測根部NO₃^-流，發現轉基因型植物根部的NO₃^-吸收速率顯著高于野生型，這為TaNAC2-5A促進作物根部NO₃^-吸收提供了最直接的生理證據。

2018年6月4日，旭月研究院前往中科院遺傳所開展了非損傷微測技術應用培訓。現場的老師同學，就非損傷檢測植物鉀營養吸收，提出了具有代表性的幾個問題。

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一、為什么測不到鉀營養吸收

1. 饑餓處理

·氮（N）、鉀（K）等營養吸收實驗的首要關注點。N饑餓、K饑餓的時間，參考文獻，一般為2-7天（C2014-022，想要文獻全文，請在底部留言您的郵箱及文獻編號）。

·有的老師可能不愿接受饑餓處理，認為對其實驗來說，又多了一個脅迫因素“饑餓脅迫”。當然，從嚴謹的角度出發，在可以接受的工作量前提下，您可以同時設置饑餓、非饑餓組，都進行嘗試。

我要說的是，在NMT沒有出現前，植物對N、K吸收的證據，主要來自于N、K含量的測定，例如ICP-MS或同位素質譜，這些檢測手段都不是實時檢測，而屬于“終點法”，即檢測一個“起點”值，再檢測一個“終點”值，二者之差，即為植物對N、K吸收的量。但事實上，NMT出現后，檢測發現，營養元素并非每時每刻都處于吸收的狀態（NMT是實時監測），而且對植物根來說，也并不是每個部位都會吸收（NMT是微米級精確定點檢測）。受傳統技術影響，需要給廣大的研究者一定的時間空間，接受這些新的結果。NMT發現植物對N、K的實時吸收信號很微弱，所以需要通過通過“饑餓”等手段，來放大這一過程，以便觀察各組間的信號差異。

2. 苗齡

·離子流的變化，在植物生理上屬于早期事件，也就是樣品在宏觀上還沒有差異的時候，離子流已經開始發生變化。反之，宏觀上已經可以察覺到變化時，離子流的差異可能無法檢測到了。所以常規的實驗時間點，與離子流的時間點，會有時間差，一般離子流檢測相比于常規實驗時間點，都要靠前。

·根據經驗，擬南芥（C2011-003）、水稻（C2014-022）、小麥、番茄等草本植物，大小一般都是3周內。如果太大，例如超過一個月，離子流信號可能就很弱了。

·特別要注意，有的老師會告訴我，用其它方法（ICP-MS）檢測發現，苗大小為30天時，可以看到鉀含量差異，或者直接告訴我希望同前期的其它實驗條件保持一致（其它實驗都有用30天的苗）。您可以去嘗試，但是我為什么不建議您用太大的苗，原因參考上文。

3.檢測液濃度

據經驗，在很多情況下，高K環境會抑制根對K的吸收。所以檢測液中的K濃度，一般設置為0.1 mM~0.5 mM。但是有些實驗要求在不同的K濃度下檢測，則可自行設置。

4.檢測位點

在“饑餓處理”中，我們已經提到，植物根部并非每個部位都會吸收K，參考文獻發現，有的是距離根尖100 μm處的分生區，有明顯K吸收（C2011-003）；還的是距離根尖1.4 cm處的成熟區（C2014-024）。所以您在實驗的最開始，需要通過對自己樣品根部各區域進行掃描檢測（簡稱“掃根”），最終確定K吸收信號最明顯的位點，繼而定點檢測。

楊樹根部NH₄⁺、NO₃^-掃根結果（C2014-025）

二、檢測K⁺時信號波動大

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1. 檢測前讓樣品在檢測液中“待”一會

解決方案：實驗的前幾個樣品多測一會，摸索穩定所需時間（平衡階段）。

樣品從培養液中，進入到檢測液里，也需要適應。所以讓樣品在檢測液中“待”一會，可能是5分鐘或10分鐘，然后再上樣檢測。這樣，就可以排除前期環境變化導致的信號波動的影響了。具體原因可觀看視頻《NMT實驗設計及作圖培訓》。

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2. 波動信號可能是重要發現

請參考現代非損傷微測技術聯合創始人許越的博文《飄忽不定的諾貝爾獎機遇：如何理解和用好NMT數據？》

這是一位老師和旭月工程師在檢測間隙，一起出去吃午飯時，無意中記錄下的數據。看出有什么規律嗎（黃線部分是他們吃飯前記錄到的）？

三、審稿人質疑K⁺傳感器測到的到底是不是K⁺

現代非損傷微測技術聯合創始人許越，教您如何應對審稿人的質疑《如何確定NMT測到的就是K⁺流|審稿人疑問解答》

截止2018年5月份，國內學者發表的NMT相關SCI文章共216篇，總影響因子為846.033。

注：SIET、MIFE、SVET、SPET等技術名稱，已經統一為Non-invasive Micro-test Technology，中文名“非損傷微測技術”，簡稱NMT。