將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達，我國也有不少醫藥研發機構提供原核表達服務。在各種表達系統中，最早被采用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。美迪西建立了成熟的大腸桿菌表達及純化服務平臺，提供包括各種重組蛋白以及其復合物在大腸桿菌中的表達與純化服務。
pET 是目前應用最為廣泛的原核表達系統，已經成功地在大腸桿菌中表達了各種各樣的異源蛋白。有專家總結了使用pET系統的過程中以及原核表達中的一些常見問題，下面我們來了解一下：
1、目的蛋白總是以不可溶的形式出現
在大腸桿菌中表達的異源蛋白經常發生錯誤的折疊，并聚集成為包涵體。經過誘導，目的蛋白通常可達細胞總蛋白的50%以上。雖然有一定比例的蛋白以可溶的單體形式存在，而多達95%（甚至更多）的蛋白則在包涵體中。實踐中，有很多實驗室采取降低誘導溫度，例如25–30°C(Burtonetal.(1991)Prot.Exp.Purif.2,432-441)，或降低IPTG濃度(0.01–0.1mM)并延長誘導時間，還有采用特別的培養基等方法獲得更多的可溶蛋白。隨著越來越多的蛋白折疊途徑被闡明，相信會出現更多有效的增加可溶性目的蛋白的實驗方法。
2、所有的位點特異性蛋白酶都有一樣的酶切特性，還是僅僅只是識別位點有所不同
位點特異性蛋白酶(例如凝血酶、腸激酶和Xa因子)通常被用來切割融合蛋白。這些酶的活性和第二點酶切傾向性很不相同。凝血酶在這三種中是特異性活性最高的，能夠有效切質量比僅為1:2000的蛋白。Xa因子似乎對于切點周圍的序列很敏感，經常會出現特異性位點切割不理想卻發生別的位點被切割的情況。腸激酶的專一性是上述三種中最好的，但由于切割效率低（通常要求質量比達到1:10）而顯得比較昂貴。另一個需要考慮的問題是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在質量比較高的酶切反應進行完后，通常要通過色譜法處理。
3、是否必須去除融合多肽或蛋白才能使目的蛋白獲得活性
大多數情況下目的蛋白帶有His?Tag，S?Tag?，11個氨基酸的T7?Tag?或HSV?Tag?等小肽時仍能表現出完全的活性。這些肽段相對都較為親水，而理論上這樣不會干擾蛋白的三維結構。建議首先測試蛋白活性，再看是否一定要去除前導序列才能適合特定的應用要求。
4、如果目的蛋白包含信號序列，它會不會被運至細胞周質并以可溶、活性形式存在或者目的蛋白甚至可以被分泌到生長培養基中
N-端如果帶有ompT或pelB這樣的前導序列是使目的蛋白進入細胞周質的必要非充分條件。如果在生長培養基中發現目的蛋白的話，多半是因為細胞壁收到破壞，而并不代表蛋白是被分泌到培養基里的。穿過大腸桿菌內膜的機制還不甚了了，已經清楚了蛋白的成熟區對轉運也有影響。雖然根據緊跟在信號肽序列后的目的蛋白序列可以對其輸出的可能作個大概判斷；但是由于蛋白的輸出效率依賴于目的蛋白的特性，還是不能僅僅根據其序列來預測輸出的實際情況。因此，實驗中，在細胞質中發現目的蛋白（仍然帶著未被切除的信號序列）或在細胞周質中有被部分加工的蛋白，在細胞周質及其它區域發現經過其它加工的蛋白，都不足為奇。某些情況下，降低誘導時的培養溫度至25–30°C，可能提高輸出蛋白的比率。
5、如果蛋白大于100kd或含有多個亞基，是否還能用細菌表達
在細菌中已經非常成功底表達了很多大蛋白，多亞基復合物則可以通過分別表達各亞基，然后在有尿素的溶液中，將各組分以適當比例混和，再透析去除變性劑。但是，自從Novagen的pETDuet和pACYDuet多表達載體被開發出來后，同時表達2－8個蛋白（亞基）變得十分容易了。
6、基因是否對大腸桿菌有毒
某個蛋白不是所謂“毒素”并不意味它就不會殺死大腸桿菌或顯著降低其生長水平。雖然有些種類的蛋白由于顯而易見的原因很容易被認為是毒素(例如，可以與DNA或干擾電子轉移)；而其它的蛋白(例如一些重組抗體)有毒則并不明顯或不易預期。如果試圖在一個有“滲漏”表達的系統中克隆和表達蛋白而遭遇失敗，基本可以認為目的蛋白對大腸桿菌有毒性。因此，對于一種新的基因的研究，基本的原則之一即是嘗試多種pET載體/宿主菌組合，以期掌握最佳表達途徑。
7. 如果IPTG誘導后細胞停止了生長，是不是表示細胞死了
T7 RNA聚合酶非常活躍，T7轉錄和翻譯信號極強，因此，一旦誘導，細胞的主要生理活動都向著目的蛋白表達的方面轉化。在通常情況下，細胞將停止生長，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成試驗可以用來檢測表達系統的性能。也有一些例外情況，例如特別的目的基因以及一些極為嚴緊的載體/宿主菌組合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，這時在誘導后菌落還是會繼續生長。
8. 除了毒性和降解，還有哪些因素會影響目的蛋白的表達水平？
（1）、mRNA轉錄子中的二級結構會干擾AUG翻譯起始密碼子和/或核糖體結合位點。如果發現表達很差，可以通過檢查編碼插入序列的鏈上的與上述序列互補的序列，以確定是否是因為存在潛在的二級結構造成麻煩。
（2）、 目的基因中稀有密碼子比較多也是常見的表達水平低的原因，如果稀有密碼子集中出現在氨基端情況更為嚴重。應該注意，跟據現有對大腸桿菌高表達的基因研究發現的有限的稀有密碼子，已經觀察到由于其對應的tRNAs水平很低，直接導致了翻譯延伸的困難。
（3）、序列中的意外的終止密碼子可能造成突變，這在PCR克隆產物的情況下較為突出。可以通過測序發現此類問題，也可以用體外翻譯的方法確認重組子的表達能力，可以選用Novagen的Red Nova 溶菌液進行測試。
9、 有時除了全長目的蛋白以外，還能看到截短的產物
出現這種情況一個最直接原因就是蛋白水解了，然而第二點翻譯起始也非常有可能。起始密碼子AUG
(Met) 的上游在RNA編碼區有類似于核糖體結合位點序列(AAGGAGG)的間隔序列(通常是5–13個核苷酸)時，容易出現這種問題。截短蛋白在純化全長蛋白的操作時往往造成麻煩。解決途徑之一即是選用兩端都帶有融合標簽的pET載體，例如pET-28和pET-30系列載體在N-端和C-端都有HisTag。這樣，全長蛋白就可以通過提高咪唑濃度，在洗脫時將截短蛋白與全長蛋白區分開。pET-29和pET-30系列載體在N-端融合有HiSTag序列而C-有HisTag，因此可以先后用固定化S-蛋白和His Bind樹脂親和純化以獲取全長蛋白。
