Western
Blot 又稱western印跡分析、免疫印記法，是一種廣泛用于檢測和分析蛋白的技術，其采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。Western印跡分析是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，美迪西生物醫藥可以提供蛋白印跡實驗技術服務
western印跡分析的工作原理：經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶標記的二抗起反應，并經過底物顯色檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白，該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。
1、關于蛋白提取：
（1） 裂解buffer：
不同的裂解buffer其用途不同，除了裂解buffer，為了防止蛋白降解、去磷酸化，各種蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑都是必須的；在提取蛋白的時候僅僅靠裂解液也不能達到完全抽提的效果，有條件的話，可以對抽提懸液進行10-20s的超聲破碎處理；此外如果沒有裂解buffer，可以用1×SDSloading buffer代替來抽提蛋白，其效果類似于SDS裂解液，不過抽提后的樣本不能進行濃度測定。
（2）干擾蛋白：
培養細胞、動物組織都存在血清成分，血清中存在大量的白蛋白與免疫球蛋白，這些蛋白會經常性的出現雜帶干擾，一般白蛋白雜帶在70kDa處，免疫球蛋白雜帶出現在50kDa處。當某種蛋白含量超過一定量的時候，即使很少的非特異吸附都有可能造成信號的富集而造成雜帶，因此在提取細胞蛋白的時候，一定要使用PBS漂洗細胞至少3次，去除殘留的培養基成分。提取組織的時候，盡量去除組織中血液的殘留，這樣樣本中的干擾因素才會減少到最低。
2、關于膠濃度及電泳條件的選擇：
正確選擇凝膠濃度與電泳條件能夠讓目的蛋白區域最大限度的分離開，從而使條帶的位置，雜帶位置等一些因素的影響降到最低。
3、關于轉膜的條件與注意事項：
（1）轉膜條件：
對于分子量10-15kDa的指標轉膜時間不宜過長，100V、冰浴45min足矣；對于分子量指標150kDa以上的指標，100V、冰浴2h也足夠了；其他介于15-150kDa之間的指標100V、冰浴1h完全可以保證效果。
（2）轉膜操作：
準備PVDF膜的大小要與切割后的凝膠大小一致或略小，濾紙和海綿大小也要一致。制作“三明治”不能太厚也不能太薄，太厚容易使膠變形，條帶彎曲，太薄氣泡容易進入，導致條帶不完整，這些都可以用增加減少濾紙量來改善；一定要把目的蛋白分子量區域貼在膜的中間部位。分清楚正極與負極，避免反方向轉印。轉印緩沖液要提前預冷，整個轉印過程也需要在冰浴中進行。
4關于分子量實際與預測結果的差異：
可能導致預測與實際分子量不一樣的因素：
（1）預染marker的誤差：
由于預染marker是由標準蛋白與有色染料偶聯而成的，所以偶聯后的蛋白由于表面結構的改變，導致在SDS-PAGE中分離的線性關系沒有天然蛋白那么好；另外由于偶聯的批次不同，每個條帶針對每個批次呈現出的分子量會有些許的變化，所以在使用預染marker的時候，出現5-10%的分子量誤差是不能避免的，如果需要確切分子量需要用非預染marker來標定。
（2）物種差異：
很多蛋白在人源、大鼠源、小鼠源中存在的長度并非完全一致，具體問題還要具體分析。
（3）蛋白本身的性質：
①分子量數值僅僅是一個氨基酸數值累加的相對值，與實際值本身存在差距；
②蛋白質存在磷酸化、乙酰基化、糖基化等翻譯后修飾可導致分子量增大，比如常見的CD家族蛋白糖基化修飾以后分子量都會增大許多；
③蛋白質存在翻譯后酶前體狀態與激活剪切狀態，可使分子量變小，比如MMP2蛋白，酶源與激活態大小分別是72kDa、63kDa；
④蛋白質存在多個轉錄本由一個基因編碼的形式，不同的轉錄本翻譯得到的蛋白分子量不一樣，比如JNK這個蛋白，本身分為JNK1，JNK2，JNK3三個亞型，三種亞型同源性較高，而且針對每個亞型還有不同分子量的轉錄本呈現；要想正確把握蛋白分量問題不僅僅要讀說明書，還要關注這個蛋白的相關背景知識。
（4）uniprot：
這個數據庫提供了關于蛋白預測分子量，亞型分類，轉錄本種類及最初發現這個蛋白的一些參考文獻，
5、關于“白板”和“黑板”：
Western結果往往就處于“白板”與“黑板”之間的某個條件：
（1）白板：“白板”代表的意義是某些條件不足：① 首先要考慮蛋白提取問題，樣本濃度是否過低，正常Western實驗每孔需要20-40μg左右的蛋白；②一抗的稀釋比例，一般新手做WB都會按照說明書的比例去做，一般說明書都是1:500-2000之間的比例，如果是白板就需要加大抗體比例，如果按說明書的最低推薦比例還是“白板”，那應該不是稀釋比例的問題了；③一抗孵育時間，常規的一抗孵育條件是4℃過夜，有時候抗體反應比較“遲鈍”可能需要更強烈的孵育時間，比如延長孵育時間至2天，或者把搖床放入冰箱緩慢搖動孵育過夜，我們不建議37℃進行抗體孵育；④ 顯色體系的選擇，一般來說ECL化學發光要比DAB靈敏5-10倍以上，所以盡量使用ECL；ECL發光液也分很多種，普通型、靈敏型、超靈敏型，我們都嘗試過，的確在信號上有非常明顯的差異；當然延長曝光時間也是提高信號靈敏度最常規的方法。
（2） 黑板：“黑板”顧名思義相對于“白板”，“黑板”代表的意義就是某些條件過量了；①
要考慮上樣量；② 降低一抗稀釋比例；③降低二抗稀釋比例，二抗其實是非常成熟的產品，質量是有保證的，我們一直在用HRP二抗，1:5000，常溫40min，基本不需要摸索二抗條件，總結起來還是一抗、二抗都要買放心廠家的；④
縮短曝光時間。
6、關于封閉
封閉也是Western中比較關鍵的環節，一般常規的條件是5%脫脂奶粉溶于1×TBST中，常溫下搖床緩慢搖晃，封閉1h，除此之外還有另外一種封閉液—0.5% 明膠，這兩種封閉液都適用于常規的Western實驗，他們之間的取舍關系可近似認為，如果用脫脂奶粉封閉結果是“白板”或者信號較弱，可以考慮換明膠，如果用明膠封閉，結果雜帶較多，背景較深可以考慮用脫脂奶粉；甚至有的時候兩者可以混合起來使用。
