5.操作步驟
5.1樣品的采集和處理
(1) 糧食：樣品用水洗三次，置60℃烤箱中拷干，磨粉，儲于塑料瓶中，放一小包樟腦精，蓋緊瓶塞保存，備用。
(2) 蔬菜與其他植物性食物：取可食部用水沖洗三次后，用紗布吸去水滴，切碎，用勻漿器制成勻漿，貯于塑料瓶中，冰箱內保存備用。
5.2測定步驟(以下步驟需在避光條件下進行)
(1)樣品提取：取適量樣品，相當于原樣1～5g(含胡蘿卜素約20～80μg)勻漿，糧食樣品視其胡蘿卜素含量而定，置100ml帶塞錐形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振搖1min，靜置5min，將提取液轉入盛有100ml
5%硫酸鈉溶液的分液漏斗中，再于錐形瓶中加入10ml丙酮--石油醚混合液，振搖1min，靜置5min，將提取液并入分液漏斗中。如此提取2～3次，直至提取液無色為止。
植物油和高脂肪樣品：需先皂化，取適量樣品(<10g)，加脫醛乙醇30ml，再加10ml
1:1氫氧化鉀溶液，回流加熱30min，然后用冰水使之迅速冷卻，，皂化后樣品用石油醚提取，直至提取液無色為止。
(注：原國標方法中，不是所有的樣品均進行皂化處理。但是許多植物性樣品由于細胞壁較厚，在勻漿或研磨過程中不易完全破壞，使胡蘿卜素無法完全釋放。并且盡管植物性樣品中脂肪含量較少，但仍含有一定脂質成分，如果不進行皂化，會出現提取不完全和提取時出現乳化現象;濃縮時殘留脂質，使定容體積不準確;紙層析展開不完全，造成測定結果偏移。所以建議除酒類、飲料外所有樣品均進行皂化處理。)
(2)洗滌：將提取液靜置分層，棄去下層水溶液，反復用5%硫酸鈉溶液振搖洗滌，每次約15ml，直至下層水溶液清亮為止。
將皂化后樣品提取液用水洗滌至中性。
將提取液通過盛有10g無水硫酸鈉的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分數次洗凈分液漏斗和無水硫酸鈉層內的色素，洗滌液并入球形瓶內。(注：經過無水硫酸鈉輔助過濾，提取液中應不含水分。)
(3)濃縮與定容：將上述球形瓶內的提取液于旋轉蒸發器上減壓蒸發，水浴溫度為60℃，蒸發至約1ml時，取下球形瓶，用氮氣吹干，立即加入2.00ml石油醚定容，備層析用。
(4)紙層析
點樣：在18cm×30cm濾紙下端距底邊4cm處做一基線，在基線上取A、B、C、D四點，吸取0.100～0.400ml濃縮液(6.3)在AB和CD間迅速點樣。(注意：保持濾紙干燥，點樣應該快速細致，在基線上形成細窄直線)
展開：待紙上所點樣液自然揮發干后，將濾紙卷成圓筒狀，置于預先用石油醚飽和的層析缸中，進行上行展開。(注：層析缸應事先用石油醚飽和，并且防止水分進入。)
洗脫：待胡蘿卜素與其他色素完全分開后，取出濾紙，自然揮發干石油醚，將位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶入試劑中。
(5)比色測定：用1cm比色杯，以石油醚調零點，于450nm波長下，測吸光度值，以其值從標準曲線上查出β胡蘿卜素的含量，供計算時使用。
(6)標準工作曲線繪制：取β胡蘿卜素標準使用液(濃度為50μg/ml)1.00、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00ml，分別置于100ml具塞錐形瓶中，按樣品測定步驟進行提取、洗滌、紙層析等操作，點樣體積為0.100ml，標準曲線各點胡蘿卜素含量依次為2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00μg。為測定低含量樣品，可在0至2.50μg間加做幾點，以胡蘿卜素含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。
6.計算
X2=c×V2×100×1………………(2)
V1m1000
式中： X2--樣品中胡蘿卜素的含量，以β胡蘿卜素計，mg.100g;
c --在標準曲線上所查得的胡蘿卜素含量，μg;
V1--點樣體積，ml;
V2--樣品石油醚提取液濃縮后的定容體積，ml;
m --樣品質量，g。
7.注意事項
同一實驗室平行測定或重復測定結果的相對偏差絕對值≤10%。
二、柱色譜法
1. 原理和適用范圍
同紙層析法，只是將紙層析換成中性氧化鋁柱層析。
2.試劑
(1) 中性氧化鋁：80～100目。用前180℃烘干4小時至恒重。
(2) 其余試劑同紙層析法。
3.儀器及設備
(1)
色譜柱：為1.0cm×25cm的玻璃柱，底端收縮變細，并有一活塞，用于調控液體流速;距底端上1cm處有一篩板，孔徑為16～30μm。用前需干燥。
(2) 其余設備同紙層析法。
4.操作步驟
4.1樣品采集和處理同紙層析法。
4.2測定步驟
(1) 樣品提取、洗滌等步驟同紙層析法。
(2) 將洗滌后提取液濃縮并定容至10ml。
(3)
柱色譜：將已干燥的中性氧化鋁浸泡于石油醚中，以濕法填充色譜柱至高度為15cm，其上端加2cm無水Na2SO4，使石油醚自由流下，保證其水平高于Na2SO4平面0.5cm。(注意色譜柱填充時應避免水分，不要有氣泡進入。)將樣品提取液加入色譜柱上，自由流下，待提取液流至柱面時，分次加入石油醚2ml，洗滌柱壁，再加入石油醚洗脫，收集流出液至黃色帶全部流出。流出液經60℃水浴減壓蒸餾后，N2吹干，定容。
(4) 比色法測定同紙層析法。
5.注意事項
(1)
柱色譜法的優點是在測定胡蘿卜素的同時可測定其他類胡蘿卜素和色素。類胡蘿卜素、色素和胡蘿卜素的極性不同，胡蘿卜素極性最小先被極性小的石油醚洗脫，增加洗脫液極性(如加入乙迷、丙酮)可先后將極性稍大的類胡蘿卜素(如葉黃素、葉紅素)、葉綠色洗脫。
(2)
紙層析法和柱色譜法均不能區分α-、β-和γ-胡蘿卜素，雖然標準品為β-胡蘿卜素，但實際結果為總胡蘿卜素。不過天然食品中大部分為β-胡蘿卜素，對結果影響不大。兩種方法測定結果相當。
(3)
HPLC的原理、適用范圍、樣品前處理及操作同紙層析法，濃縮定容后的樣品液不經過紙層析，而進入HPLC的C18柱，經流動相洗脫后，用紫外分光光度計檢測。HPLC可分離α-、β-胡蘿卜素并可同時測定多種脂溶性維生素，是目前國內外常用的測定方法。但目前本實驗室尚沒有建立此法。
