瓊脂糖凝膠電泳法

　　瓊脂糖凝膠電泳法 凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術。根據制備凝膠的材料:凝膠電泳分：瓊脂糖電泳;聚丙烯酰胺電泳

　　一、實驗目的 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法

　　二、實驗原理 ? 瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。 ?DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。 ? DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區帶。 ? 瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應，遷移速度與分子量的對數值成反比關系。因而就可依據DNA分子的大小使其分離。該過程可以通過把分子量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。 ? 溴化乙錠(EB)為扁平狀分子，在紫外光照射下發射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。據此可粗略估計樣品DNA濃度。

　　注意事項： ? EB是致癌物質，切勿用手接觸，更不要污染環境。 ?實驗過程中操作要保持安靜、鎮定，注意樣品不能混樣，

　　三、實驗材料、器具及藥品 以前實驗中提取的小麥總DNA和質粒樣品。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠(EB)，6X載樣緩沖液

　　四、實驗步驟

　　⑴ 1g 瓊脂糖加入100ml 1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。(冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并搖勻。)

　　⑵ 用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當梳子，將溶解的瓊脂糖(約50℃)倒入，室溫冷卻凝固。

　　⑶ 充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。

　　⑷ 用移液器吸取總DNA或質粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。

　　⑸ 打開電源開關，調節電壓至3-5V/cm，可見到溴酚藍條帶由負極向正極移動，電泳約30min-60min。

　　⑹ 將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。

　　⑺ 將染色后的凝膠置于紫外透射檢測儀上，蓋上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到發出熒光的DNA條帶。 植物總(核)DNA樣品應呈現一條遷移率很小的整齊條帶。質粒DNA應呈現一到三條不同構型的條帶，這時表明所提樣品較純。溴酚藍前的熒光區是樣品中存有的RNA雜質。若質粒DNA樣品在遷移率小的地方還有熒光條帶，表明質粒DNA樣品中有細菌的染色體DNA污染。

　　瓊脂糖電泳的優點

　　(1)瓊脂糖含液體量大，可達98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴散度比自由電泳小。

　　(2)電泳速度快。

　　(3)透明而不吸收紫外線，可以直接用紫外檢測儀作定量測定。

　　(4)樣品易回收，常用于制備。配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據被檢的DNA分子大小來確定。

　　瓊脂糖凝膠濃度與線性 DNA分辨范圍 凝膠濃度(%) 線性DNA長度(bp) 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 常用的電泳緩沖液 緩沖液 濃貯存液(每升) Tris-乙醇(TAE) 50×：242g Tris堿57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(Ph8.0) Tris-硼酸(TBE) 5×：54g Tris堿27.5硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(Ph8.0) 4℃ 保存備用. 常用的6X載樣緩沖液 Ⅰ 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚藍 ，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液