PCR原理與應用

　　聚合酶鏈反應 (PolymeraseChainReactionm,PCR)是一項體外基因擴增技術,1985年美國PE公司人類遺傳研究室發明了該項技術,Saiki等首先應用于鐮狀紅細胞貧血的產前診斷,但由于操作方法繁瑣未能全面推廣應用。直到1988年耐熱DNA聚合酶(Taq酶)的發現和應用, 使PCR技術變得極為簡單,才被迅速應用于分子生物學、生物工程、醫學、法醫學和農學等領域,PCR技術已經作為分子生物學發展道路上一個里程碑，永載史冊。

　　(一)PCR技術的基本原理 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成： ① 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備 ② 模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合; ③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau)。 到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。在此同時認識到蛋白質是接受RNA的遺傳信息而合成的50年代初Zamecnik等在形態學和分離的亞細胞組分實驗中已發現微粒體(microsome)是細胞內蛋白質合成的部位;1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對它們在合成蛋白質中轉運氨基酸的功能提出了假設;1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質合成過程中mRNA與核糖體的結合;1965年Holley首次測出了酵母丙氨酸tRNA的一級結構;特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認識了蛋白質翻譯合成的基本過程。從分子生物學的發展過程，可以看到在近半個世紀中它是生命科學范圍發展最為迅速的一個前沿領域，推動著整個生命科學的發展。至今分子生物學仍在迅速發展中，新成果、新技術不斷涌現，但分子生物學的歷史還短，積累的資料還不夠。例如：在地球上千姿萬態的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是極少的一部分，還未認識核酸、蛋白質組成生命的許多基本規律;又如即使到2005年我們已經獲得人類基因組DNA3×109bp的全序列，確定了人的5-10萬個基因的一級結構，但是要徹底搞清楚這些基因產物的功能、調控、基因間的相互關系和協調，要理解80%以上不為蛋白質編碼的序列的作用等等，都還要經歷漫長的研究道路。可以說分子生物學的發展前景光輝燦爛，道路還會艱難曲折。④、特異性強 作為引物的寡核苷酸與模板結合的正確性是決定反應產物是否特異的關鍵。⑤、對原始材料質量要求低含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA，就可以用做反應起始材料來獲取目的產物。

　　(二)PCR技術的應用1、生命科學　　a、人類基因組計劃隨著的PCR日臻完善，科學家于2003年在完成的人類基因組“工作框架圖”的基礎上，經過整理、分類和排列后得到的更加準確、清晰、完整的基因組圖譜。這是對人類基因組基本面貌的首次揭示，表明科學家們開始部分“讀”出人類生命“天書”所蘊涵的內容。b、后基因組計劃 人類基因組DNA序列圖譜完成后，鑒定基因組多態性及其單倍型以及尋找其在生物和醫學應用中重要成為人們關心的熱點。以研究基因功能為核心的“后基因組時代”已經來臨，大規模的結構基因組、蛋白質組以及藥物基因組的研究計劃已經成為新的熱點。c、物種的分類、進化及親緣關系 可以進行物種進化的保守性分析及物種多態性分析、物種鑒定。2、醫藥　a、疾病的診斷和治療 遺傳性疾病：如地中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏等有遺傳傾向的疾病，尤其是老年性疾病，如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分，均可預測;癌基因的檢測和診斷：檢測惡性腫瘤的標記物來診斷癌癥等疾病;利用基因治療方法治療腫瘤性疾病。b、致病病原體的檢測 檢測范圍包括細菌、病毒(SARS及禽流感病毒H5N1等)、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物。檢測的靈敏度和特異性都遠高于當前的免疫學方法，所需時間也已達到臨床要求，這對于難于培養的病毒(乙肝)，細菌(如結核、厭氧菌)和原蟲(如梅毒螺旋體)等來說尤為適用。c、DNA 指紋、個體識別(DNA身份證)、親子關系鑒別和法醫物證可以用一根頭發、一個細胞、一個精子來完成上述工作，這一領域也已發展到骨髓或臟器移植配型。 d、生物工程制藥 許多藥物可通過工程菌和細胞來大量生產，如干擾素、白介素、促紅細胞生長素等藥物。e、轉基因動物制藥及疾病模型 轉基因動物與醫學及生物醫藥研究的關系越來越密切。近年來,各種人類疾病轉基因動物模型不斷建立。如轉基因動物在遺傳病、心血管疾病、腫瘤、高血壓病、病毒性疾病、異種移植、輸血醫學、藥理學研究中的應用;利用轉基因動物-乳腺生物反應器生產藥物蛋白,好比在動物身上建“藥廠”,可以從動物乳汁中源源不斷地獲得具有穩定生物活性的基因產品。這是一種全新的藥物生產模式,具有投資成本低,藥物研制周期短和經濟效益高等優點。 f、中藥材真偽鑒別　利用DNA分子的特征進行物種鑒別的DNA分子標記鑒別法,與現有的中藥鑒別方法相比具有以下主要特點:1)準確性高、重現性好,真實、穩定、可靠;2)不受樣品形態的限制,原藥材、飲片、粉末乃至含有生藥原型的中成藥(丸劑、散劑等)均可應用;3)所需檢樣量少,對珍稀藥材及化石標本的鑒定更具應用價值;4)PCR技術的快速、便捷性使得DNA分子標記鑒別法更適宜推廣使用。3、農業科學 a、轉基因植物 按其功能主要分提高產量、抗病力、抗除草劑、改良品質和發育調節。如:大豆、玉米、馬鈴薯、番茄等。b、轉基因動物 在農業方面，主要在改良畜禽生產性狀,提高畜禽抗病力及利用轉基因畜禽生產非常規畜產品。4、環境科學 a、環境生態研究 PCR-FLP技術為環境地球化學提供了一種新的研究方法和實驗設計的新的思維方式。此方法具有所需樣品量低、快速簡便及特征性強等優點,可廣泛應用于物質的生物地球化學循環、環境過程的生物作用、生物多樣性及有機物源判斷等方面的研究。展望未來研究成果,將會在海洋及湖泊沉積物等自然環境中發現更多的、新的微生物種類;將進一步闡明生物作用和物質循環的機理和過程;進一步闡明自然環境中生物大分子的變化機理及其環境效應并找到判斷沉積物有機物。b、環境監測 長期以來檢測外環境(水樣中的霍亂弧菌、空氣中產氣莢膜桿菌、海洋中已知病菌及有害生物如藻類等)均用傳統的分離培養方法,既繁瑣耗時,檢出率又低，而用 PCR方法能快速、準確地檢測外環境致病性細菌盒有害生物。5、考古學及歷史事件解讀 利用人類短串聯重復STR-PCR技術，研究人類種族的遺傳多態性，效果非常穩定。目前此技術已廣泛用于生物考古、種系發育、民族學、人類學和考古學等各個領域中。 6、衛生安全 a、食品微生物的檢測 傳統的致病菌檢測首先經過長時間的培養，費時費力，應用PCR技術則非常迅速、準確。主要用于：食品致病菌的檢測，如肉毒唆菌等;乳酸菌的檢測;水中細菌指標測定。b、轉基因食品的檢測 目前世界轉基因食品已經有100多物種，大多數已經用于食品。轉基因食品對人體健康的危害及對生態的影響也日受世界廣泛的重視，因此對轉基因食品的檢測成為控制其泛濫的一種手段。c、動、植物檢疫　靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛，檢查出入國門的人員、動、植物(種畜、種籽)等是否攜帶烈性傳染病(艾滋、動物病毒、植物病毒等)病原體，食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外，是提高我國綜合國力的必要保證。