DH10Bac感受態細胞制備發方法

　　前言：DH10Bac感受態細胞本身含有卡那霉素和四環素抗性。在制作感受態細胞的時候，需要加入這兩種抗生素，以防止DH10Bac中的質粒父本桿粒bMON14272(卡那霉素抗性)和輔助質粒pMON7124(四環素抗性)在細胞擴增過程中丟失，提高質粒轉化后的基因轉座效率。

　　實驗步驟：

　　1. 在含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB平板或無抗平板上，使用DH10Bac菌液劃線，37oC培養箱過夜，培養12~20小時。

　　2. 從平板上挑取一個單菌落，接種到一個含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液體培養基中，于37℃，250rpm培養3-6小時，至OD600值為0.4左右。

　　或者從平板上挑取一個單菌落，接種到一個含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的5 ml LB液體培養基中，于37℃，250rpm培養12小時，然后再將菌液按照1:100的比列接種于含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液體培養基中，于37oC，250rpm培養3小時，至OD600值為0.4左右。

　　3. 將DH10Bac細菌培養燒瓶在冰上孵育10 min，使培養物冷卻至0℃，轉入無菌的預先用冰預冷的50 ml離心管中，然后于4℃下5000 rpm離心8 分鐘收集細胞。

　　4. 倒出培養液，盡量使上清棄盡。每50 ml初始培養物加入30 ml預先用冰預冷的0.1 M CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置30分鐘。

　　5. 于4℃，5000 rpm離心8 分鐘收集細胞，棄盡上清。加入4 ml預先用冰遇冷的0.1 M CaCl2。輕輕吹打懸浮細胞，加入1 ml滅菌的預先用冰遇冷的80%甘油，吹打混勻。

　　6. 將DH10Bac感受態細胞按照毎管100 ul分裝。可以直接使用新鮮制備的DH10 BAc感受態細胞進行質粒轉化，也可以放在-80 ℃冰箱保存備用。

　　備注：

　　1. DH10Bac感受態細胞制備的整個過程中應當嚴格無菌操作。

　　2. 提前配制包含工作濃度為50 ug /ml的卡那霉素和10 ug/ml的四環素的LB培養基100 ml，其中添加100 mg /ml的卡那霉素50 ul，10 mg/ml的四環素100 ul。

　　3. 懸浮、分裝細胞時，預先將槍頭預冷，EP管事先標明清楚并置于4℃或-20℃冰箱預冷。

　　4. DH10Bac感受態細胞喜冷不喜熱，嚴格執行冰上操作步驟，保證整個過程中感受態細胞的低溫狀態時獲得高效感受態細胞的關鍵。

　　5. 用于轉座的pFastBac1等載體自身含有慶大霉素的抗性，并且轉座是否成功可以通過藍白斑進行篩選，因此在使用pFastbac1載體質粒進行DH10Bac感受態細胞轉化時平板應該使用含有卡那霉素，四環素抗性和慶大霉素的三抗平板。同時，在平板中加入IPTG和X-gal以進行藍白斑篩選，鑒定轉座是否成功。