發現直接克隆大片段DNA方法
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下一篇 2012-05-04 12:09:53
眾所周知,微生物能夠產生大量具有生物活性的次生代謝產物,比如抗生素(紅霉素),抗癌藥物(埃博霉素)以及殺蟲劑(阿維菌素)等等。近年來盛行的細菌基因組測序工程表明,細菌染色體上存在著大量未鑒定的天然產物生物合成基因簇,又稱為“孤兒基因簇”。微生物次生代謝產物大多數是由聚酮合成酶(PKS)和非核糖體多肽合酶(NRPS)等大型復合酶合成的。但是由于一些細菌不能在實驗室條件下生長,或者這些“孤兒基因簇”在實驗室條件下是沉默的。
因此,將這些生物合成基因簇克隆到大腸桿菌的載體上,通過修飾或者替換啟動子,然后在一些生長快,易培養和遺傳操作簡單的異源宿主中表達,是一種發現這些沉默天然產物的有效方法。而且,這些基因簇還可以通過基因刪除,插入和交換,產生更多的
“非天然”的天然化合物,也就是所謂的天然產物的“組合生物合成”。
但是這些天然產物的生物合成基因簇一般都大于10kb,
有的甚至大于100kb。現行的克隆DNA片段的方法不能滿足高通量的功能基因組學研究的需要。比如PCR技術和全新的DNA合成只能得到小于5kb的
DNA片段。黏粒或者細菌人工染色體(BAC)基因文庫的構建和篩選是克隆大型天然產物
生物合成基因簇的經典方法。但是這些方法還需要后續的費時費力的篩選以及復雜的基因簇縫合工作。
留學德國的中國學者符軍和卞小瑩在張友明博士的主要指導下發現了基于重組工程的直接克隆大片段DNA的方法。傳統的重組工程方法一般使用大腸桿菌中的λ
噬菌體Red 操縱子中的Redα, Redβ and Redγ來實現大腸桿菌中的線性DNA片段和環狀DNA之間的同源重組。大腸桿菌中的Rac
前噬菌體也包含一對跟Red功能相似的蛋白RecE和RecT
也能用于重組工程。但是先前的研究發現RecE一般只用碳末端的588個氨基酸就足夠完成有效地同源重組,盡管不如Red體系效率高。所以Red體系在廣泛地應用在基因敲除、插入和修飾等。RecE蛋白包含866個氨基酸殘基,遠遠多于跟它功能相同的蛋白Redα(226個氨基酸殘基)。因此研究人員發現全長的RecE蛋白和RecT蛋白能高效的催化兩個線性DNA分子的同源重組。
進而,研究人員利用新發現的線性DNA分子的同源重組能夠準確的從BAC或者酶切的染色體混合物中直接克隆選擇的DNA片段。研究人員應用該技術從純化的發光桿菌的染色體上直接克隆了十個未知的天然產物的生物合成基因簇(PKS/NRPS,10-52kb),并將它們在大腸桿菌中表達,鑒定了其中兩個基因簇的最終產物。全長的RecE蛋白和RecT蛋白介導的直接克隆方法極大的豐富了DNA重組工程技術,也將加速微生物天然產物的生物探礦研究,同時,此項技術還可以應用于人類個體醫療中的基因診斷和研究。相關研究成果發表在國際著名期刊《自然—生物技術》上,由德國德累斯頓工業大學,德國亥姆霍茲感染研究中心,中國湖南師范大學和德國基因橋公司合作完成。
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TAG: dna方法