流式細胞儀的工作原理

　　流式細胞儀是一種集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機以及細胞熒光化學技術為一體的新型高科技儀器。其結構一般分為5部分：流動室及液流驅動系統;激光光源及光束形成系統;光學系統;信號檢測、存儲、顯示分析系統;細胞分選系統。

　　流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢，因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室內充滿了鞘液，鞘液的作用是將樣品流環包，鞘液流是一種穩定的液體流動，鞘液以勻速運動流過流動室，在整個系統運行中流速是不變的，樣品流在鞘液的環包下形成流體力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，并且保證每個細胞通過激光照射區的時間相等，從而得到準確的細胞熒光信息。

　　目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強度及穩定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細胞快速流動，每個細胞經過光照區的時間僅為1μs左右，每個細胞所攜帶熒光物質被激發出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發光的強度有關，因此細胞需要足夠的光照強度。 激光光束在達到流動室前，先經過透鏡將其聚焦，形成幾何尺寸約為22μm×66μm，即短軸稍大于細胞直徑的光斑。這種橢圓形光斑激光能量分布屬正態分布，為保證樣品中細胞受到的光照強度一致，須將樣本流與激光束正交，且相交于激光能量分布峰值處。

　　FCM的光學系統是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成， 主要光學原件是濾光片，主要分成3類：長通濾片(long-pass filter，LP)、短通濾片(short-pass filtr，SP)及帶通濾片(band-pass filter，BP)。它們分別將不同波長的熒光信號送到不同的電子探測器

　　散射光信號：

　　散射光分為前向角散射(forward scatter，FSC)和側向角散射(side scatter,SSC)，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(如染色)，因此被稱為細胞的物理參數或稱固有參數。以上兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同。

　　(1)前向角散射：前向角散射與被測細胞的大小有關，確切地說，它與細胞直徑的平方值密切相關。通常在FCM應用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。

　　(2)側向角散射：側向角散射是指與激光束正交90°方向的散射光信號，側向散射光對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內精細結構和顆粒性質的信息。

　　熒光信號的線性測量與對數測量：

　　當攜帶熒光素的細胞與激光正交時，受激發發出熒光，經過濾光片分離不同波長的光信號分別到達不同的光電倍增管(PMT)，PMT將光信號轉換成電信號。電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數放大。

　　細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質含量等的測量一般選用線性放大測量。

　　在細胞膜表面抗原等的檢測時，細胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍。如用線性放大器，將無法在一張圖上清晰地將細胞陽性群、陰性群同時顯示出來通常使用對數放大器，如果原來輸出是1，當輸入增大到原來的10倍時，輸出為2;當輸入增大到原來的100倍時，輸出為3等。