實驗目的
1.掌握堿裂解法小量提取質粒DNA的原理和方法。
2.掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒DNA方法。
3.熟悉質粒DNA提取與真核細胞核DNA提取的異同點。
實驗原理
在pH值為12.0～12.6的堿性環境中，在去垢劑SDS的作用下，細菌的細胞壁與細胞膜均破裂，釋放出大量的染色體DNA、RNA及質粒
DNA。此時，所有雙鏈DNA解聚成單鏈，但質粒DNA仍保持環狀。當pH值恢復到中性時，在高鹽濃度下，大分子量的染色體DNA只是部分復性，相互交織成不溶性的網狀結構，與細胞碎片、部分蛋白質和大分子量的RNA一起沉淀，并可通過離心除去。而環狀的質粒DNA可以完全復性，溶解于上清中，從而達到初步分離的目的。
采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過漂洗液將雜質和其他細菌成分去除，最后以低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。
操作步驟
1.取1.5ml過夜培養的菌液，12000 rpm，離心30s，棄上清，盡可能倒干，收集菌體沉淀。
2.用100μl 溶液I(50mmol/L Tris-HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)重懸菌體沉淀，Tip吹打至徹底懸浮。
3.加入150μl 溶液II(0.2mol/L NaOH, 1% SDS)，輕輕顛倒混勻4~6次，使充分菌體充分裂解，室溫放置5
min，直至溶液變得清亮。
4.加入150μl 溶液III(4mol/L 鹽酸胍，0.5mol/L KAc pH4.2)，立即溫和顛倒混勻4~6次。室溫放置5 min，12000
rpm離心10 min，小心吸取上清。
5.加入400μl 結合緩沖液(5mol/L 鹽酸胍，20mmol/L Tris-HCl pH6.6,
37.5%乙醇)于離心吸附柱中，然后將步驟4中的上清加入吸附柱中(不要將沉淀移入吸附柱)，混勻，套入收集管中，12000 rpm離心30
s，倒掉收集管中的廢液。
6.加入750μl 漂洗液(20mmol/L NaCl, 2mmol/L Tris-HCl pH7.5, 80%乙醇)于離心吸附柱中，靜置1min
，12000 rpm離心15 s，倒掉收集管中廢液。
7.重復步驟6一次。
8.再次于12000 rpm空離心2 min，盡量除去漂洗緩沖液中的乙醇。
9.取出離心吸附柱，將其套入一個干凈的1.5ml Eppendorf管中，在硅基質膜中央部位加入50μl洗脫緩沖液(10mmol/L
Tris-HCl, 1mmol/L EDTA pH8.0)，室溫放置2 min，12000 rpm離心1 min。
10.丟棄離心吸附柱，溶液中含有目的質粒DNA，置于4℃或-20℃保存。
注意事項
1.
所用器具必須嚴格清洗，最后要用雙蒸水沖洗3次，凡可以進行滅菌的試劑與器具都要經過高壓蒸汽滅菌，防止外源性核酸酶對DNA的降解以及其他雜質的污染。
2. 細菌培養容器最好用三角燒瓶，其容量至少應為培養液體積的四倍，從而保證氧氣的供應。細菌培養不要超過16
h，否則細菌會崩解，引起細菌大量死亡，導致質粒丟失。
3. 溶液I在用前加入RNase A，并置于4℃保存。
4. 在堿裂解提質粒的方法中，關鍵之一是加入溶液III的時機，這決定了DNA變性與復性的時間。既要使溶液II
與染色體DNA充分作用使之變性，又要保證質粒DNA不會因作用時間過久而發生不可逆的變性。若質粒變性過度，將引起提取效率下降、內切酶切割困難等一系列問題。因此，加入溶液II切忌劇烈振蕩，時間不應超過5
mins。
5. 加溶液溶液III離心后，倘若上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
6. 本試劑盒優點：快速、方便;產量高、純度好;毒性低：采用硅基質膜離心柱純化質粒DNA，不需酚、氯仿抽提。
