高親和力抗Met人源基因工程抗體scFv的篩選與特性分析

[摘　要] 　目的:應用噬菌體展示技術制備抗HGF受體Met特異性、高親和力的全人抗體scFv片段。方法: 以從天然抗體庫中篩選出的Fab基因可變區VH和VL 為模板,分別在CDR 區引入有限突變和隨機突變,擴增出scFv基因庫,克隆于pComb3XSS中,構建scFv次級突變抗體庫,篩選高親和力克隆。結果: 經5輪細胞篩選和2輪抗原固相篩選,選取60個克隆進行EL ISA檢測,選擇較高親和力的噬菌體抗體,克隆于原核表達載體pBAD2gIII/A中,經誘導表達、SDS2PAGE和Westernblotting分析,在相對分子質量30 000處出現預期大小的蛋白條帶。單鏈抗體經表達、變性與復性和IMAC親和純化后,用于流式細胞術、免疫沉淀分析,結果表明, scFv能夠與S114細胞表達Met的胞外區特異性結合,其親和常數Kd值為4. 76 ×10 - 8mol/L,與突變前抗體的親和力( Kd值為5. 24 ×10 - 6mol/L)相比,抗體的親和力提高約100倍。競爭EL ISA結果顯示,親和力成熟后抗體的抗原結合表位未變。結論: 經過CDR突變和抗體庫篩選,有效提高了抗體的親和力,該抗體有望成為臨床腫瘤診斷或治療的候選分子。