在追求經濟的驅動下，生物分離技術在朝最大程度減少浪費、提高產能的方向進展，連續
色譜法也開始進入了小分子領域。
要生產治療用蛋白，層析技術理所當然是生物分離的“圣杯”，Howard Levine博士，生物處理技術咨詢公司的經理評價道。隨著競爭日益激烈，生物制藥公司等待生物制品的出現，成本問題推動了降低消耗提高產出的新型生物分離技術的發展。更高的流量和結合性能是當前層析系統的標志，而可移動的膜層析系統有助于進一步降低成本和浪費。
同時，經濟因素把層析技術，至少是它的形式，帶到前所未有的地步，引入到更多小分子處理領域。
總的來說，不論是大分子還是小分子蛋白的生產，都因需要降低處理中的浪費而推動層析技術的發展。“生物技術不能接受每個步驟50%的損失，”Pall
生命科學公司的高級
科學家，John Jenco博士說。
下游生物處理技術正在進步，以跟上上游工藝所獲得的巨大進步。“我們已在上游和下游工藝取得了巨大進展，當然總的看來，下游的純化工藝還沒有與上游的生產同步，”Amgen公司的科學指導Duncan Low在波士頓去年9月份召開的IBC生物處理國際會議上如是說。
層析技術與發酵相比，經濟規模小，Low說。“你無需修改生物反應器的圖紙就可以擴大發酵規模，但這不適用于層析柱，”他說。
據Low所說，從1980年的5-50mg/L到今天，蛋白滴度增加了上千倍，爭取在未來的3-5年增加到10-20g/L。高滴度意味著單位蛋白的體積變小，這有助于下游操作，而生物量的增加沒有這個作用。
純化專家已經提供了很多改進，包括：
◆ 處理的集成和強化；
◆ 澄清工藝使用化合物濾膜；
◆ 更有效的樹脂利用（包括重復利用）和更高的產品回收率；
◆ 可供選擇的下游策略，如膜吸收器，液液分離，以及可移動性。
高處理量和蛋白滴度增加了下游總體處理，尤其是層析處理的壓力，Eric Grund，GE醫療公司的Fast Trak 生物制藥的主管認為。即使如此，生產商仍致力于提供樹脂和其他層析產品以改善流速和結合力。
惠氏準備噸級MAb的生產
由于高劑量單克隆抗體的成功，發酵正轉移到越來越大的容器中進行。“毫無疑問，公司正在規劃噸級的蛋白生產規模，”惠氏生物制藥的純化工藝研發主管，Brian Kelley說。惠氏，考慮到近期研發階段有3個單抗產品以及生產線上的12個產品，正在計算工藝強化和層析平臺策略對下游工藝的挑戰，這些措施可通過內部或向生產商訂購而過渡。
惠氏研發部門的科學家已經把下游單抗普遍的3步層析步驟減為2步，蛋白A樹脂作最初的截留，繼以陰離子交換沖洗。惠氏略過了中間過渡柱——一般離子交換型憎水結合或羥基磷灰石，而是在截留前仔細清除細胞碎片，優化了該步驟，同時盤旋截留柱和陰離子交換柱獲得最高的效率和產量。
公司采用充滿樹脂的微孔作為微柱
檢測不同pH、離子強度和洗脫條件下的吸附和解吸附。通過優化離子交換步驟完成兩個柱子的工作，要花一天時間，僅耗費約1g樣品。“我們正在尋找陰離子交換步驟的最佳條件，”藥物研發高級主管Jeff Deetz說。
其他公司和生產商正研究使用微觀方法來優化較大型的層析柱。通過與Ciphergen在工藝蛋白組學的合作，Pall現已提供高通量層析篩選服務，以制定生產規模的層析方法。在SELDI質譜技術基礎上，此項技術是在包覆各種吸附介質的ciphergen的蛋白芯片上迅速篩選結合和洗脫條件。“該技術允許我們幾小時就能做過去采用小層析柱幾天甚至幾個月的工作，”Jerold Martin，Pall 公司科學事務的高級副經理說。
由于下游工藝的工作量賴于上游的生產效率，生物工藝專家必須早作決定，如何處理低容量的固定階段，采用一根柱子（分批處理）或多根柱子。分批處理以彌補層析容量的不足會導致工藝的不確定性，也就是更多事務會出錯。
公用資源如緩沖液的制備，會在生產中引起不止是共享瓶頸的問題。多重層析柱的每一根柱子需要相同的一打緩沖液和清洗液，遍布生產車間，只能在有限的容器中生產。提前制備好這些復雜的緩沖液減少了緩沖液相關的規劃錯誤，但增加了額外的儲存成本（如不銹鋼儲液罐和額外的地面空間）。
“根本的瓶頸問題是調度，”Intelligen公司的規劃和調度經理Charlie Siletti說，該公司提供了工藝調度產品SchedulePro來消除此類難題。“大多數廠商沒奢侈到有一打儲液罐。”
即使出現因資源共享導致的延遲，多數生產商沒有采用簡單的預防，如在各操作間留出緩沖時間，尤其是在發酵和截留層析之間。“進入下游操作的批次后來影響了隨后的批次。”Siletti說。
親和層析，一度是生物處理技術的標志，得到創新發展以減少層析步驟。現在親和配體包括金屬螯合物，染料類似物，蛋白和免疫蛋白，以及更多普通蛋白A。
包括在親和類下的還有對毫微抗體蛋白產品特異性的親和樹脂。此類樹脂把憎水性的電感層析與小分子結合起來，模擬天然的蛋白結合位點，與蛋白A類似物，或其他特異性的親和蛋白相近。定制的樹脂價格昂貴，但對量大的生物制品也是負擔的起的。
供應商努力使蛋白A配體化學惰性，經得起清洗。GE醫療公司的堿性穩定蛋白A，今年早些時候面世的，就是這些努力的結果。
當然，還有一些人志于采用較為廉價的單元操作替代蛋白A和其他層析步驟。一些幸運的生產商，如Abbott實驗室已經可以完全略過親和截留介質。
在其他情況下，可以應用較為低廉的蛋白A模擬樹脂，如Pall公司的HyperCel單抗選擇性樹脂，價格為蛋白A的1/3，可被濃縮的腐蝕液清洗，還有親和層析有限公司，Prometic 和其他廠商提供的模擬配體。
小分子層析：促銷
說服小分子生產商采用柱層析生產要花費一些力氣。由于生產規模大，小分子柱層析成本高，又耗費時間。大型層析柱產生了大量溶劑，造成火災的風險，也需要溶劑回收，大生產中洗脫的大量組分增加了
分析任務，造成長的循環時間。“結晶會破壞層析，而且情況很普遍，” 惠氏化藥研發部副經理Michael Kolb博士說。
Kolb列舉了層析、溶劑回收、能源和安全的資金成本，以及處理大量溶劑引入的成本，以此作為根本障礙。“想想看，那是非常昂貴的化合物，”Kolb說，“超過99%的情況下，我們采用結晶法來純化化合物。”
然而，支持者認為，層析技術還是有令人稱道之處，尤其是不易結晶的化合物。連續層析提供了諸多生產的便利，正用于生產幾種大規模的制劑，包括UCB公司的抗癲癇藥物Keppra（levetiracetam），紐約Forest實驗室生產的Lexapro/Cipralex（escitalopram）以及哥本哈根的H. lundbeck A/S。可供的選擇有：模擬流化床層析（SMB）- 從20世紀60年代起在石油工業中發展起來的連續純化技術，SMB已廣泛應用在
食品、化學、制藥領域，最近已拓展到生物技術領域。SMB解決了藥物生產商關心的問題，提供了很多便利，純化單位材料使用較少溶劑，比批次層析的分離度高。
20世紀90年代，Novasep公司發展SMB并引入了制藥領域。它的生產規模的連續SMB系統采用多重柱層析，柱直徑可達1米。
Varicol-Novasep的另一項工藝，據說比SMB效率高20%。SMB要使用4根柱子，靠固液相的相對移動而分離，Varicol結合了共流和逆流運動，比SMB少用1至2根柱子，可達到相近的分離效果。在分離外消旋混合物中的對映體時有非常好的分離度。
Varicol 和SMB都是兩相分離系統，意味著只能純化兩種成分的混合物（準確的說就是外消旋物質的分離）。這就是經過手性層析分離后的化合物首先經過結晶消除洗脫快或慢的雜質。
Novasep也銷售制備和生產型的
高效液相色譜，批次操作，從小分子到大分子蛋白采用的柱子直徑可達1.6米。公司與費城的羅姆公司合作一項生物層析設備，基于高效樹脂發展生物分子的分離。目前已研究了幾項蛋白工藝，但仍不能用于單抗類的大分子。
由于分離無用對映體的成本非常高，只有當手性能通過復消旋回收并再次流經手性柱，手性層析法才有意義。回收可使產率達90%以上，如果手性中間體沒有自然消旋。“你必須以環形的合成方式考慮手性層析技術。”Novasep 母公司的主席Jean Blehaut說。
循環或“穩態循環”層析法與SMB在以下幾方面不同：
采用一根柱子而非四根；容量和生產量較低；仍處于早期研究或
實驗室階段而非生產階段。
在Eli Lilly公司，循環層析保證了生產規模達1公斤的藥物的回收率。
為分離外消旋體，循環層析要在洗脫過程中不斷注入外消旋溶液，速率與主要的異構體洗脫速率相同。通過收集需要的流分，循環層析未分離的部分，提高了每次分離的分離度。
“循環本質上把柱長增加了兩到三倍，”Eli Lilly 的首席科學家 Joseph H. Kennedy說。“比
標準的批次層析，柱載量提高了很多。”其他的好處比如，比SMB縮短了研發時間，設備簡單，成本更低，方法的耐受性好，可達基線分離。
循環層析的缺點是，作為兩相分離技術，雜質問題不容忽視。迅速洗脫的副產物不象主峰后的拖尾讓人頭疼，但分離這些副產物決不簡單。
“沒有理由解釋循環層析不能放大，但SMB已發展到普遍應用到生產中的地步，”Kennedy說。“如果你有個手性分子能夠結晶，這方法通常比層析法好。但現在制備的很多分子不能結晶。”
下游工藝的Abbott流水線
Abbott實驗室的單抗純化旗艦平臺采用陽離子交換而非親和截留，改變了給料方式和隨后的下游工藝。據純化小組的領導James Stout博士介紹，工藝學中，較早時，上游工藝的困難是去除母細胞，以及性質與目標分子相近的蛋白雜質（親和層析可能不會出現次問題）。Abbott也會遇到蛋白聚集、破碎，母細胞蛋白的變異性，蛋白變性和沉淀，以及常見的容量問題。
每升樹脂能結合100g或更多蛋白的超級樹脂的出現，且不會破壞分離度和生產量，有助于協調上下游容量矛盾。Abbott實驗室也重視舊操作中的問題如結晶，選擇沉淀或液液萃取可降低處理量，雜質量，以彌補層析法的不足。
Abbott相信工藝分析最終有助于減輕上下游工藝容量的不匹配。為去除雜質，工藝規劃和層析曲線可為細胞培育提供反饋，以減少某一副產品。“基于生產/純化和分析，層析法一定是這些評估的中心，”Stout補充說。
對傳統的柱層析而言，膜吸附技術可能是一個替代措施，“但全方位衡量后層析法仍占優勢。”
