一篇Science谷氨酸受體調節鈣離子的文章解讀

Science文章解讀：發現了質膜上編碼Ca²⁺通道的新基因glr
--發現了質膜上編碼Ca²⁺通道的新基因glr

譯者注：這篇文章中的工作Feijó在2007年、2008年已經做了很多實驗，只是當時沒有最合適的突變體、激活劑（如D-Ser）、抑制劑（如DNQX等），因此沒有投到高水平的雜志上，之前的工作也有實力問鼎這樣的雜志。所以，Science的文章并非是一朝一夕的工作，而是長期的積累，但是非損傷微測技術為這項研究提供了直接的證據和便利的手段，在將來的研究中越來越重要，尤其是研究活體材料的必備技術。

這篇文章揭示了氨基酸調節植物信號傳遞的機制，這種機制和動物中的神經傳遞系統相似，為我們認識植物的信號傳遞打開了一扇新的大門。

D型絲氨酸調節谷氨酸受體構成的Ca²⁺通道

標題：花粉管中的谷氨酸受體相似基因構成的Ca²⁺通道受到雌蕊D型絲氨酸的調節

作者及單位：Erwan Michard,^1* Pedro T. Lima,¹  Filipe Borges,¹ Ana Catarina Silva,¹ Maria Teresa Portes,¹ Jo?o E. Carvalho,¹ Matthew Gilliham,² Lai-Hua Liu,³ （劉來華）
Gerhard Obermeyer,⁴ José A Feijó^1,5

1．葡萄牙古爾班基安科學研究所【2011年3月1日，古爾班基安科學研究所（簡稱IGC，http://www.igc.gulbenkian.pt/）《科學家》雜志公布的生物醫藥領域博士后最佳工作地點排行第9名，是國際知名的生物學研究機構。】
2．澳大利亞阿德萊德大學懷特研究所，農業、食品和釀酒學院【阿德萊德大學(University of Adelaide，www.adelaide.edu.au )是2010年世界排名81的大學，同時也是澳大利亞最古老最享有盛譽的澳洲八大名校之一，位于南澳洲首府阿德雷德市中心。】
3．中國農業大學資源環境學院植物和土壤相互作用重點實驗室
4．奧地利薩爾茨堡大學分子生物學系分子植物生物物理和生物化學實驗室
5．葡萄牙里斯本大學，里斯本大學是葡萄牙最重要的教學和科研中心
通訊作者：José A Feijó；Email：jfeijo@fc.ul.pt

摘要

細胞質游離Ca²⁺濃度的增加構成了真核細胞基本的信號轉導機制，但是Ca²⁺通道蛋白如何啟動植物中的這個信號一直存在爭論。這里，我們通過藥理學和缺失功能的煙草和擬南芥的突變體說明谷氨酸受體類似基因（GLRs）減少了通過質膜的Ca²⁺內流，進而調節花粉管頂端胞質中的Ca²⁺濃度梯度，最終影響花粉管的生長和形態建成。此外，敲除花粉管絲氨酸消旋酶（SR1的突變體）后GLRs活性下降，導致生長發生缺陷。這項研究揭示了氨基酸調節雄性配子體和雌蕊組織之間全新的信號轉導機制，這種機制類似于動物神經系統的常見機制。

前言

花粉管是研究細胞尖端生長的模式系統。一般情況下細胞的生長是通過分裂生殖，如酵母、絲狀真菌、神經元和根毛。

花粉管在體外生長時出現規律性的振蕩和相同的周期，但是這種振蕩經常出現在不同的生長階段。這包括囊泡運輸、胞吐作用、肌動蛋白微絲的聚合、頂端離子流動、胞質pH和Ca²⁺濃度的變化。所有這些振蕩的細胞相互作用與生長速率的振蕩相關，特別在體外條件下，這種現象在許多物種中觀察到并且做了分析。

當前，這些細胞的特征不明顯，這些振蕩已經被證明沒有生理作用。然而，尖端的Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]cyt）梯度和振蕩與其他轉導機制相呼應，這作為一個生長的中心調控機制已經被廣泛接受，并且參與下游的外部方向的指引過程，例如NO或者LURES。以前，花粉中Ca²⁺通道的活性通過電生理的技術已經得到研究，或者通過環核苷酸門控通道的遺傳學分析，發現在分子水平Ca²⁺通道在液泡膜（TPC1）上表達，但是截至到現在，連接一個特異基因到各自質膜Ca²⁺通道的活性的證據在植物細胞中獲得。

在這項工作中，我們研究了植物同源異型體對離子型谷氨酸受體（GLR）家族的作用，發現這種作用在[Ca²⁺]cyt梯度中產生，振蕩是通過頂端的Ca²⁺內流而產生，因此我們得出結論認為花粉管形態建成和導向過程中Ca²⁺通道具有中心作用。

研究結果

1．GLRs形成Ca²⁺通透通道控制PT [Ca²⁺]cyt和生長
GLRs增加[Ca²⁺]cyt，導致質膜去極化，激活非選擇性陽離子通道（NSCC）的活性；GLR特異抑制劑：DNQX 250 μM, CNQX 250 μM and AP-5 50 μM；對煙草花粉管生長速率抑制的效果：AP-5 > CNQX > DNQX；四種氨基酸處理：D-serine、glycine顯著增加了生長速率, L-serine, L-glutamate對生長速率沒有影響；花粉管尖端的質膜Ca²⁺通透的GLR通道被D-Ser誘導，被CNQX抑制。

2．GLR的活性控制[Ca²⁺]cyt

3．Atglr1.2和Atglr3.7敲除的植物有雄性生殖的表型

4．GLR1.2和GLR3.7控制通過擬南芥花粉管質膜的Ca²⁺流速

5．D-Ser在離體條件下對PT的生長有激活作用

注：PT是指花粉管；[Ca²⁺]cyt是指細胞質中的Ca2+濃度

討論和結論

在花粉管尖端區域D-Ser激活GLRs，讓Ca²⁺通透進入細胞質，因而通過調節Ca²⁺內流的強度和振蕩的幅度影響Ca²⁺標簽。

在植物提取物中測定了D-Ser的濃度（μM），免疫定位結果表明在植物組織中有強烈的濃度差異。然而，我們不能推翻絲氨酸消旋酶在其中的影響，之后的20min內脫水酶的活性超過消旋酶的活性。

動物的GLRs在中樞神經系統快速興奮的神經傳遞過程中扮演著重要作用，包括神經發育中的神經可塑性，以及參與完整的認知過程，例如記憶和學習。這些數據解釋了基于信號轉導的氨基酸的保護作用，包括振蕩。類似的通道通過影響Ca²⁺誘導的神經遞質釋放的特殊動力學特征來發揮作用。其他氨基酸（GABA）離子型受體共同參與了花粉-雌蕊的相互作用，因此我們得到了一個有趣的相似結果，即植物組織和器官中的細胞與細胞之間交流的機制多種多樣，這種機制具有廣泛的作用。

我們在花粉管中第一次報道了環核苷酸門控通道基因是不確定的Ca²⁺通道，這歸功于花粉管中GLR通道和Ca²⁺振蕩的生理作用，這種作用在振蕩和花粉管形態建成之間建立了直接的關系。Ca²⁺振蕩直接參與到保衛細胞Ca²⁺信號轉導的編碼過程中。這里我們證明他們在花粉管生理功能中也具有重要作用，但也不僅僅通過信號轉導的產物控制花粉管的生長和在雌性組織間的導向。

進一步研究發現，花粉管生長模型可能揭示植物細胞和調控網絡影響形態建成和Ca²⁺振蕩的分子機制。

圖注

Fig. 1. Whole-cell Ca²⁺ currents in tobacco pollen tube tip protoplasts. (A and B) Effects of D-Ser (1 mM) ± CNQX (86 μM), respectively, on currents recorded at V = 0 mV. The V protocol is presented in (A) (same time scale as current traces). (C) Average current changes of experiments as presented in (A) and (B) (n ≥ 3). (D and E) fast voltage-ramps (+80 to -60 mV) applied before (plain line) and after perfusion with D-Ser ± CNQX (dashed line) during the experiments presented in (A) and (B). +80 mV pulses preceded the voltage ramp. (F) Average shift of Erev shift induced by D-Ser, CNQX and D-Ser + CNQX treatments (n ≥ 3). Error bars indicate standard deviation.

煙草花粉管尖端原生質體的全細胞的Ca2+電流。
A和B，D-Ser（1mM）± CNQX (86 μM)對電流的影響，電流是在V = 0 mV時所記錄的。D-Ser加入后增加了Ca2+電流，D-Ser和CNQX同時加入后減小了Ca²⁺電流，說明CNQX本身以及對D-Ser引起的Ca²⁺電流具有抑制作用。D-Ser, CNQX and D-Ser + CNQX影響了Erev的轉變。

GLRs參與Ca2+內流振蕩的發生。
非損傷微測技術（vibrating-probe or NMT）記錄了煙草花粉管尖端的Ca²⁺流速，D-Ser (1 mM)促進了Ca²⁺內流，CNQX (250 μM)減小了Ca²⁺內流，DNQX (250 μM)減小了Ca²⁺內流。n=5-6（重復次數）。柱狀圖是用平均流速增加或者減少的Ca²⁺流速表示。

Fig. 3. GLR1.2 is involved in Arabidopsis pollen tube morphogenesis and in Ca²⁺ apical influx oscillations. (A) RT-PCR analysis for GLR1.2, Vanguard1 (At4g12730 - pollen specific) (20), AtEXP1 (At2g47040 absent in pollen) (20), and TUB4 expression in wild-type pollen (lane 1) and seedlings (lane 2). Lane 3 is PCR performed on genomic DNA (positive control). (B) Atglr1.2-1 insertion line showing T-DNA located within the second exon. The transcript. from GLR1.2 was not detected by RT-PCR in inflorescence of Atglr1.2-1 (insert). Number of seeds per silique in wild-type, Atglr1.2-1 and GLR1.2-anti-sense plants (distribution curves, n > 100). (C) Arabidopsis wild-type pollen tube grown in the presence of CNQX (172 μM, upper panel), and Atglr1.2-1 pollen tube grown in control condition (lower panel). (D) Typical Ca²⁺-specific vibrating probe recordings in growing pollen tube of wild-type and Atglr1.2-1. (E) Effect of CNQX (172 μM) on Ca²⁺ apical influx in wild-type pollen tubes. (F) Ratio of oscillating Ca²⁺-flux in Atglr1.2-1 compared to wildtype in the presence of CNQX compared to control condition (wild-type plants).

GLR1.2參與擬南芥花粉管的形態建成和尖端Ca²⁺內流的振蕩。
glr1.2-1和CNQX都導致Ca²⁺內流的減少。

Fig. 4. D-serine increases [Ca²⁺]cyt in Arabidopsis pollen tubes. (A) Typical YC3.6-Cameleon imaging in a growing Arabidopsis pollen tube (n = 10). Upper and lower panels respectively depict the minimum (*) and maximum (**) [Ca²⁺]cyt at the tip of the same cell. (B) After D-Ser (5 mM) application tubes exhibit an increase in [Ca²⁺]cyt (n = 7) and an extension of the gradient toward the sub-apical zone. (C and D) Kymographs from the tubes presented in (A) and (B), respectively. Each horizontal line of the kymograph illustrates the [Ca²⁺]cyt values along a line traced in the middle of the tube at one time point. The slope of the kymograph represents the growth rate of the tube. Note the increase in [Ca²⁺]cyt and activation of oscillations by addition of D-Ser. Color scale represents the FRET ratio (3 ≈ 100 nM and 6 ≈ 0.5 μM) (3).

D-Ser增加了擬南芥花粉管的[Ca²⁺]cyt 。

Fig. 5. D-serine controls Arabidopsis pollen tube growth in planta. (A) Effect of 100 μM D-Ser on Arabidopsis wild-type pollen tube apical Ca²⁺ influx. Note the increase in oscillation amplitude. (B) GUS activity in mature pistils from transgenic plant lines transformed with the serine-racemase promoter (1800 bp) cloned upstream of β-glucuronidase. (C and D) D-Ser immunolocalization in wild-type and sr1-1 pistils (D-Serblue; red is autofluorescence, merged for structural correlation). (E) Insertion line with a mutation for serine-racemase (sr1-1). No serine-racemase transcript. was detected in insertion line (insert: RT-PCR on cDNA from flower). Images show callose staining on sr1-1 pistils pollinated with wild-type pollen. Note balloon-like tip and branched pollen tubes which are not observed in wild-type.

D-Ser控制花粉管的生長。
100 μM D-Ser增加了野生型擬南芥花粉管尖端的Ca²⁺內流的振蕩幅度。
B．擬南芥成熟雌蕊中β-葡萄糖糖苷酶上游的絲氨酸消旋酶啟動子（1800bp）的GUS的活性。
D-Ser在野生型和sr1-1 pistils雌蕊中的免疫定位，D-Ser藍色，紅色的是自發熒光。
插入絲氨酸消旋酶的突變，RT-PCR沒有檢測到絲氨酸消旋酶的轉錄。