新策略改善蛋白質相互作用分析

　　美國Dana-Farber癌癥研究所癌癥系統生物學中心(CCSB)的研究人員將PCR拼接與新一代測序結合起來，用于蛋白質的相互作用網絡分析。該研究成果近日發表在《自然—方法學》(Nature Methods)在線版上。

　　細胞中存在著成百上千個大分子的相互作用，它們介導的功能維持了正常的細胞活性。為了大規模確定多種生物中的相互作用，人們已經開發出多種高通量的方法，如酵母雙雜交系統。然而，目前的高通量蛋白相互作用組(interactome)的數據集質量雖高，但覆蓋度很低。對于人類而言，95%以上的相互作用組還有待定位。

　　酵母雙雜交系統等高通量定位方法的瓶頸在于確定相互作用的蛋白、DNA或RNA分子的身份。新一代測序技術的補充有望提高通量，同時降低成本。近幾年來，新一代測序廣泛應用在生物學的多個方面，但尚未應用在蛋白質的相互作用網絡定位，因為通過集體測序無法了解每個相互作用對的成員之間的關聯。

　　盡管“鳥槍法”測序能夠高效測定基因組和轉錄組，但新一代測序技術無法直接鑒定相互作用對。于是，Dana-Farber癌癥研究所Marc Vidal領導的研究小組將PCR拼接(PCR stitching)與新一代測序結合起來，開發出一種大規模并行定位相互作用組的策略(Stitch-seq)，并在高通量酵母雙雜交系統中檢驗了這種策略。

　　他們通過PCR將編碼相互作用對雜交蛋白的開放閱讀框(ORF)或cDNA擴增出來，并通過Sanger或新一代測序來鑒定。X與DNA結合結構域融合(DB-X)，Y與激活結構域融合(AD-Y)。當X和Y來源于配對PCR平板的記錄位置，它們可通過計算機重組，形成相互作用序列標簽(ISTs)。

　　作者提到，他們的策略使整體費用降低了近40%，并允許通量增加。隨著新一代測序技術的不斷改善，測序費用應當持續下降。作者在研究中選擇了454 GS FLX測序平臺。之所以選擇這個平臺，是因為454技術是新一代測序中讀長最長的，而82 bp的接頭長度要求平均讀長要超過100 bp，才能可靠鑒定相互作用序列標簽。

　　作者認為，Stitch-seq不僅適用于酵母雙雜交系統，還可擴展到其他類型的相互作用分析，改善相互作用組網絡定位的能力和范圍。