比色分析法通過比較溶液對光的吸收程度以測定物質的含量。
一、比色測量儀器
(一)比色測量儀器的基本部件
比色測量儀器一般包括以下五大部件。
1.光源
在光電比色計和可見光分光光度計中，采用6～12V的鎢燈，其最適宜的波長范圍是360～1000nm，為使光的強度穩定，須用穩壓裝置來穩定電壓。
2.波長控制器
在光電比色計中采用濾光片作為波長控制器。濾光片是有色玻璃片，其作用是從光源發出的連續光譜中分出實驗所需的某一特定波長范圍的光，即獲得適當波長的近似單色光。
選擇濾光片的原則是濾光片最易透過的光，也就是溶液最易吸收的光。即濾光片的顏色與溶液的顏色應互為補色，這是因為有色溶液對它的互補色光有最大的吸收。581-G型光電比色計通常只有紅、綠和藍三塊濾光片。例如，要測定KMnO4溶液，就應選用綠色濾光片。
分光光度計采用單色器來控制波長。它可以把連續波長的光分解，從中得出任一所需波長的更純的單色光。單色器包含有狹縫調節、透鏡系統以及色散元件。
為自準式單色光器。光源發出的光經入射狹縫由凹 面準直鏡反射后的平行光投在棱鏡上，經棱鏡色散后的光又經準直鏡反射到出射 狹縫，轉動棱鏡便可在出射狹縫得到所需波長的單色光。
3.吸收池
吸收池供比色時盛溶液用，它是用無色透明、厚度均勻的玻璃制成的。其透光的兩面嚴格平行。同一系列的測定中，所用的比色皿必須配套，即同一配套比色皿盛有同一溶液在同一波長時測得的透光率誤差不得越過0.5%。實驗時可根據溶液的濃度不同選擇。0.5,1.0,2.0,3.0cm不同規格的比色皿。比色皿要保持清潔，透光面要注意保護，不得用手直接接觸或用粗糙的濾紙擦拭，以免劃傷表面，影響吸收程度。若外壁有液珠，應用濾紙吸干后再用擦鏡紙擦凈。
4.光電轉換器
它是將光能轉換成電信號的器件，常用的有光電池和光電管。
光電池 常用的硒光電池如圖8-6，適用 于380～750nm波長范圍。當光線照射到光電池時，電子從半導體表面逸出。由于硒的半導體特性而在電路中產生光電流。將光電池與一個靈敏檢流計相聯，在照射光強度不太大且外電路電陰很小時，光電流大小與照射光的強度成正比。因此可根據光電流的大小測量透過溶液的光強度。
硒光電池的優點是光電流較大，可不必經過放大而直接用靈敏檢流計測量。有時當光電池受強光照射或連續使用時間太長時，容易產生“疲勞”，這時需使其在暗的狀態下暫作恢復，方可繼續使用。
光電管 由封裝在真空透明管中的一個半圓柱型陰極和一個絲狀陽極組成(圖8-7)。陰極凹面有光電發射材料層，被光照射可發電子。當兩極間加有電壓時，發射出來的電子就流向陽極產生光電流。發射出的電子數目與射在該表面上光束的強度成正比。光電管產生的電流啼弱，經放大器放大后可由微安電表直接指示出吸光度或透光率。
5.檢流計
用光電池作光電轉換器的比色測量儀器中，檢流計一般采用懸鏡式光電反射檢流計，其靈敏度較高，能測量10-9A(安培)的電流。檢流計有吸光度A和百分透光率T(%)兩種刻度標尺，可直接讀數。
標尺上透光率T是等分的而吸光度A的刻度是不均勻的。透光率T可用小數或百分率表示。A與T的關系可推導為：
例如，已知某溶液對某一波長的光吸光度為0.04，其透光率可由下面方法求得。
0.04=-lgT
lgT=-0.40
T=0.398=39.8%
又如,已知某溶液對某一波長光的透光率為65%,吸光度為:
對于用光電管作光電 轉換器的儀器,由于加了放大器,可方便地連接微安電表、記錄儀，數字顯示器等指示器，也可以調節電橋平衡的方式讀數取數據。
(二)比色測量儀器
1.光電比色計
光電比色計用光電池和檢流計測量透射光的強度并直接可讀出百分透光率T(%)或吸光度A。它是利用濾光片把鎢燈產生的白光中與測定無關的光除去，使入射光盡可能是接近溶液補色的單色光，從而提高了比色分析的準確度。
2.721型分光光度計
721型分光光度計的工作波長范圍為360-800nm。采用真空光電管作為光電能量 轉換元件，在整個可見光區都比較靈敏。同時采用晶體管放大電路和電表直讀結構，儀器的靈敏度和穩定性都比較好。
由光源發出的連續輻射于聚光鏡上，經平面鏡轉角90度反射到入射狹縫，射入單色器。入射光經過準直鏡反身射在出射狹縫上，再經過聚光透鏡后進入比色皿。經溶液吸收后的透射光通過光門照射在光電管上轉換為光電流信號，經過入大后輸入檢流計，由電表直接顯示吸光度。
二、比色分析的測量方法
無論是光電比色計還是分光光度計，最常用的測量方法有如下兩種。
(一)標準曲線計
先配制一系列不同濃度的標準溶液，用選定的顯色劑顯色。選用合適波長的入射光(光電比色計用濾光片，分光光度計可轉動波長調節器)。測定時先以空白溶液調節透光率100%，然后分別測定標準系列的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標作圖得到一條通過原點的直線，叫做標準曲線(或稱工作曲線)。
例如，測定維生素B12時，可預先繪制維生素B12的A-c標準曲線，再用完全相同的方法和步驟測定被測溶液的吸光度，即可從標準曲線上找出被測溶液的濃度或含量。
這種方法叫做標準蛐線法。標準曲線可在固定儀器和方法的條件下多次使用，適合于經常性工作。但若儀器不同或測定方法及條件改變，測得的標準曲線不同。因此在更換任何測定條件時都需重新繪制標準曲線。
(二)直接比較計算法
若僅對個別樣品進行測定，且A-c曲線線性良好，可水作標準曲線而直接比較測定結果。
先配制一個被測物質溶液濃度相近的標準溶液，與被測溶液在相同條件下測定吸光度。根據下式可以計算。
A標=K標c標b標
A測=K測c測b測
由于使用同一波長的入射光，采用同樣的比色皿，測定同樣的物質。所以
K標=K測
b標=b測
因此A標/A測=c標/c測
則c測=A測/A標×c標