摘自于：色譜雜志
摘要：用薄層色譜(TLC、)高效液相色譜-光電二管陣列檢測器(HPLC/DAD)、動物實驗等方法對生物檢材中烏頭生物堿進行，并對這些方法進行比較。結果發現，TLC法為此類藥物檢驗篩選的首選方法，最小檢出量為0.3μg。在進行HPLC檢測時，以烏頭生物堿的特征紫外吸收光譜和動物實驗結果為重要的定性手段，其特征吸收波長為(228±2)nm和275±2)nm。烏頭生物堿在2g/L~50MG/l時其色譜峰面積與質量濃度有很好的線形，想國系數為0.9996。經實際案件證明，方法準確、靈敏，可用于生物檢材中烏頭類生物堿的檢驗。
關鍵詞：薄層色譜;高效液相色譜‘烏頭生物堿;動物實驗
中圖分類號：O658 文獻標識碼：A 文章編號：1000-8713(2002)01-03
烏頭生物堿是一類常見的毒性強烈的毒物。它種類繁多，結構復雜，穩定性差，其有效成分及毒性隨產地、季節、炮制方法不同而呈現較大的差異。在我國，烏頭生物堿中毒的案件時有發生，尤其在中藥炮制中服用過量及誤服事件更為常見。在這類案件的實際檢驗中，較多的是對有毒植物及可疑藥物進行檢驗，而對生物檢材中烏頭生物堿的檢驗少有報道。通過高效液相-光電二極管陣列檢測器(HPLC/DAD)法及動物實驗方法進行檢驗更為少見。筆者在幾起死因不明而懷疑為烏頭堿中毒案件中，分別對可以藥物及死者胃內容物、肝臟進行檢驗，取得了較好的結果。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
高效薄層板(GF254(青島海洋化工廠);離心機，轉速為4000r/min(上海手術器械廠);高效液相色譜儀HP-1100 HPLC，帶DAD(美國惠普公司)。
空白肝臟(取自乙醇中毒死亡案件的死者);實驗用鼠為15g~20g小白鼠，兩周齡。
試劑：甲醇、乙腈為色譜純;氯仿、無水乙醇、無水硫酸鈉、冰醋酸、鹽酸，均為分析純;去離子水。烏頭生物堿對照品(購自中國藥品生物制品檢定所)。
烏頭生物堿標準溶液(100mg/L)：精確稱取烏頭生物堿對照品10mg溶于100ml無水甲醇中。碘化鉍鉀：取次硝酸鉍200mg、碘化鉀 5g、碘2g、濃鹽酸1ml和冰醋酸1ml，加水溶解，稀釋至250ml，置于冰箱內保存。
1.2 檢材提取
取死者胃內容物5ml, 離心5min。取上清液調PH為8~9，用氯仿提取、無水硫酸鈉脫水，置于60℃下KD濃縮器中揮干，備檢。
取研碎的死者肝10g，加入2mol/L Hcl 20ml，在80℃水解2h，冷卻，離心。取上清液調PH為8~9，用氯仿提取、無水硫酸鈉脫水，在80℃下揮干，備檢。空白肝臟的提取同上等量平行操作。
取可疑藥物5g ，用15ml無水乙醇浸泡 24h，離心，取上清液揮干，備檢。
1.3 檢驗
1.3.1 薄層色譜法(TLC)檢驗
吸附劑：硅膠G;展開劑：A為環己烷-二乙胺(體積比為9：1)溶液，B為環己烷-乙酸乙酯(體積比為1：1)溶液，C為苯-二氧六環-二乙胺(體積比為7：2：1)溶液;顯色劑：碘化鉍鉀;
將上述檢材提取物分別用甲醇200μl溶解，進行TLC分析。展開后將展開劑揮干，放入碘化鉍鉀顯色3s，取出觀察。
1.3.2 HPLC分析
色譜柱：1 Phenosphere CN 5μm(250mmx4.6mm ID);2 Pypersil 5μm C18 BDB(250mmx4.6mm ID).流動相 A：0.001mol/L KH2PO4+0.001mol/L 十二烷基磺酸鈉; B：5%乙腈;C：甲醇。流動相梯度0min~10min, V(A):V(B):V(C)=65:5:30; 10min~20min,V(A):V(B):V(C)=40:14:46; 20min~25min. V(A):V(C)=15:85; 25min, V(A):V(B):V(C)=44:10:46.
取上述檢材提取物分別用甲醇200μL溶解，取20μL進行HPLC分心。
1.3.3 標準工作曲線
配制烏頭標準溶液2mg/L, 5mg/L,10mg/L,30mg/L,50mg/L,80mg/L, 100mg/L進行HPLC分析，以其峰面積Y對質量濃度X(mg/L)作標準工作曲線，得線性方程Y=-0.2805908+14.11653XM, r=0.9996 線性范圍2mg/L~50mg/L。
1.3.4 動物實驗
毒餌配制(按不同提取法分為3組)：
第一組 取可疑藥物5g，置于10ml水中浸泡24，揮至3，備用。
第二組 取可以藥物5g，置于10ml 1%乙酸紅加熱浸泡24h，揮至3mL，備用。
第三組 取可疑藥物5g，置于15ml無水乙醇中加熱浸泡24h，揮干，再用5ml 1%鹽酸溶解，加堿至中性，濃縮至3ml備用。
取小白鼠9只，平均分為3組，禁食12h后，分別向各組白鼠胃中注入對應組別可疑藥物提取液各1ml/只，結果第1，3組白鼠中毒死亡。