酶標儀單、雙波長檢測的比較

在用酶聯免疫法測定抗原或抗體時，不論是定量試驗還是定性試驗都要求使用酶標儀進行測定。一般的酶標儀在測定中均有單波長和雙波長的模式，并且采用的都是垂直光路。但在日常工作中有時會不太重視單波長和雙波長的選擇，對使用單、雙波長給測定結果帶來的較大差異也不很了解，并且實際工作中也出現了使用單波長檢測導致抗HCV部分弱陽性的漏檢。因此，本人就酶標儀在選擇單、雙波長使用方面談談個人的體會，供同道參考。

一 材料和方法

1.材料 由上海科華公司提供的乙肝表面抗原測定試劑盒;eppendorf 20-20ul的移液器。

2.儀器 上海科華公司的ST-360酶標儀和BIO-RAD 550酶標儀。

3.方法 底物液配制：底物液A、B各5ml混合，加入微量酶標記物，再加入5ml終止液，呈微黃色，混勻待用;利用上海科華公司提供的乙肝表面抗原試劑盒的酶標板，用94孔中準確加入150ul配制好的上述底物液，另2孔中加入150ul已終止的空白底物液作空白。在BIO-RAD 550酶標儀上分別進行450nm單波長和450nm及655nm(無630nm)的雙波長檢測，在ST-360上分別進行450nm單波長和450nm及630nm的雙波長檢測吸光度各兩次。

二　結果

1.分別對所得結果進行統計，發現單、雙波長測定結果有較大的差異，雙波長測定結果的CV值遠小于單波長測定，結果見表1。

2.對ST-360兩次重復測定結果進行分析，結果基本一致，見表2。

表1 酶標板吸光度在兩臺酶標儀上的測定統計結果

表2 ST-360酶標儀兩次吸光度測定統計結果

三　討論

1.酶標儀與分光光度計、自動生化分析儀等的吸光度測定有所不同，一般分光光度計是水平光路，而酶標儀則是垂直光路，但測定原理相同，都是使用朗伯-比耳定律，測定的都是樣本的吸光度。垂直光的特點是標本吸光度受液體濃縮或稀釋的影響小，不足之處是受被測樣本液面是否水平、酶標板透光性、孔底是否平整等的影響較大。

2.酶標儀在用單波長測定吸光度時，除受到測定干擾(樣本的濁度、干擾色等)和電路干擾(包括噪音、漂移、電壓等)等因素外，受液體表面張力的影響也很大。在檢測過程中，由于液體表面張力的作用，液體的表面不是一個平面，而是形成一個凹面，從側面看似凹透鏡，這樣不可避免會影響光路的正常通過。由于凹液面的影響，光線在通過液體時，除正常被液體吸收一部分外，尚有部分被折射和反射(如光線通過凹透鏡那樣)，影響吸光度的檢測。而酶標儀使用的又是通過光導纖維傳播的點光源，如果每次能在同一部位檢測，吸光度的重復性將得到保證，但由于機械運動等造成的誤差，不可能保證每孔都在相同部位被檢測，因此造成了孔與孔之間有一定的差異。結果見表1，整塊板單波長檢測的CV在3%以上，吸光度最高值和最低值的相對誤差達17%以上。

3.在雙波長測定中，減少了測定干擾和電路干擾，因此測定結果明顯好轉，結果見表1，整塊板樣本的CV在2%以下。ST-360在進行穩定性觀察中，如表2所示，兩次檢測結果基本一致，這表明ST-360的穩定性較好。同時，從表1也可以看到，科華公司生產的ST-360與BIO-RAD 550的檢測結果一致，兩者的檢測性能基本相同。

4.由于液體表面張力的不同，導致單波長測定時的誤差較大。并且用不同的洗滌劑會影響到最后加入底物和終止液后的液面情況，用加入表面活性劑的洗滌液清洗后，形成的液面更凹，對單波長檢測的影響更大，并且與表面活性劑的濃度成正比。而且中性蒸餾水洗滌后，單、雙波長檢測的結果基本一致。

5.在酶聯免疫法測定抗原抗體中，由于所使用的底物不論是鄰苯二胺(OPD)-H2O2，還是四甲基聯苯胺(TMB)-H2O2，顯色終止后，在630nm和655nm處的吸光度值都只有吸收峰處(492nm/450nm)吸光度值的1%以下，因此，利用雙波長檢測，不會影響檢測靈敏度。建立在進行酶聯免疫檢測時，酶標儀比色應該首選雙波長。這樣可以提高臨界值處標本的分析正確度，減少實驗誤差。