紙上談藥，一個暢銷藥的奮斗史（3-）——No drug is good drug ！

　　Robert F. Furchgott

　　引子：記得小時看武俠片，一般絕頂高手都會解碼武功的最高境界——“無招勝有招”。其實最好的用藥方式就是不用藥。不過我們今天要談到的“NO Drug”并不是不用藥，而是一個傳奇的分子——一氧化氮。 的確有不少暢銷藥就跟它有關。今年一月份，美國匹茲堡大學的陳豐原教授來實驗室訪問，有幸一起陪同吃飯。他是一氧化氮和心血管方面的專家，席間跟我們講起了NO發現那段驚心動魄的故事，當天晚上我很想把這段故事記錄下來，無奈水平有限，他說的一些外國人的名字我都拼不來沒法動筆，只好重新慢慢收集資料做些功課，中間經過一個春節雜事很多也一直沒下決心寫。今天想起他講的故事，開始第三次“紙上談藥”的歷程吧。因為是故事，所以會有些“藝術加工”，雖然不是 “純屬虛構”，但是“如有雷同，純屬巧合，敬請見諒”吧!

　　在正式開始故事之前，有必要提一下諾貝爾，這段且稱為“NO前傳”吧。

　　1898年12月，Alfred Bernhard Nobel 去世前不到兩個月的一天，他給他的一位同事留言：“醫生給我開的藥竟然是硝酸甘油，難道這不是對我一生巨大的諷刺嗎?”言外之意，醫生居然給我吃炸藥?!沒錯，Nobel發明了炸藥，硝酸甘油就是其中的主要成分。不過在他之前還有其他的貢獻者。1867年，Brunton發現亞硝酸戊脂的物質，可以緩解心絞痛，同時可以降低血壓;1846年，意大利化學家Sobrebro發明了硝酸甘油，但這是一種極不穩定的能夠引起爆炸的液體;1867年，諾貝爾發明了安全使用硝酸甘油的方法，他將硝酸甘油同二氧化硅混合在一起，這樣液態的硝酸甘油就變成了半固體狀硝酸甘油炸藥;1879年，英國倫敦 Westminister醫院的William Murrell提出將硝酸甘油稀釋后就可以轉變成一種無爆炸性的物質，該物質可以作為心絞痛的藥物。硝酸甘油隨即成為一線藥物，暢銷世界，直到今天還是。盡管當初人們并不清楚其中的機理，但是絲毫不妨礙它的使用。就在諾貝爾去世的100年之后，即1998年，諾貝爾獎授予了揭開這個謎團的工作。冥冥中，經過一個輪回!

　　我們故事的主人公就是獲得1998年諾貝爾獎的三位科學家。現在有請男一號，Robert Francis Furchgott 。Furchgott 生于1916年，1937年在在北卡大學修完化學，然后于1940年在西北大學獲得生物化學博士學位。有時真是感慨沒生在那個年代，拿個博士學位好像不用花太長時間，不像現在至少都是5、6年。在華盛頓大學呆了幾年之后，逐漸有了點名氣，隨后去了紐約州立大學downstate分校醫學中心做了藥理教授。這也是他一生中工作時間最長的一個地方。直到2009年去世。他的工作單位在一個黑人聚居區，很偏僻，治安和環境都不是太好，在今天看來這絕對不是一個好的選擇。相比今天大學生傾向去的“北上廣”，那里大概相當于我們的二三線小城市，而且是經濟不算很發達的。那個時候，各種內源性的化學物質相繼發現，乙酰膽堿、腎上腺素、組胺等等。Furchgott 把主要精力放在了，研究這些物質對血管平滑肌的作用，也就是今天的體外藥理實驗。實驗裝置也很簡單，把新西蘭大白兔的主動脈取出來，剪成螺旋狀的血管條，一頭固定，另一頭連著一臺張力換能器，血管條泡在恒溫的水浴槽中，然后往水浴槽里添加各種藥物，觀察血管的收縮反應。Furchgott每天就干這個事，樂此不疲，而且一干就是幾十年，逐漸成了這個圈內的“權威”。

　　早在1953年，那時Furchgott還沒有去后來的單位，他發表了首篇乙酰膽堿和組胺致兔離體血管條收縮的論文，然而整體動物靜脈注射乙酰膽堿或者組胺卻引發了血管舒張的效應。Furchgott堅持自己的實驗重復性很好，而且觀察無誤。1955年，Furchgott在一篇綜述中提出假說——血管平滑肌上也有兩種膽堿能受體，跟腎上腺素的alpha和beta受體一樣。盡管后來，有別的實驗室發現了乙酰膽堿對離體血管的舒張作用，不過礙于 Furchgott的權威，再加上乙酰膽堿對非血管平滑肌的作用是收縮效應，幾乎所有的人都沒有深究。

　　解鈴還須系鈴人。直到1978年一次偶然事故，謎團終于被Furchgott自己撕開。那天是個值得紀念的日子，5月5日。早晨一到實驗室，Furchgott照例給助手David布置了實驗任務，然后匆匆忙忙出了門。David那天可能是跟女朋友鬧分手，女朋友一個勁勸他離開這個鬼地方，David心情不是很好，做實驗時也心不在焉，不過教授布置的任務還得繼續。下午，教授回來了，他給教授匯報結果。這次結果很奇怪，不應該這樣啊?于是，Furchgott領著他重新核查實驗細節，David顯得有些慌張。很快，教授發現了問題所在，不過并沒有責怪他，只是叫他明天按照今天的步驟重復一遍，嚴格的重復一遍，他點點頭。

　　具體說來，Furchgott給助手David布置的任務是這樣的。如圖1。把血管條掛上實驗裝置后，先加入apha受體阻斷劑，這樣血管平滑肌上的 alpha受體就被阻斷劑封閉了。然后加入乙酰膽堿使得血管有一個預收縮的過程。跟著加入腎上腺素，血管平滑肌就開始舒張，這是因為腎上腺素對血管平滑肌上的alpha和beta受體都能激動，如果事先封閉了alpha受體，那么腎上腺素只能激動beta受體，表現出的就是舒張效應。也就是說血管平滑肌上 beta受體介導舒張。

　　Furchgott在核查實驗細節時，發現了David的兩個失誤。一個是David處理血管條標本時，并沒有把主動脈剪成以往的螺旋狀，而是直接掛在裝置上;二是，David加藥時弄錯了，他忘了加入alpha受體阻斷藥，而且把腎上腺素和乙酰膽堿的加入順序搞反了，更糟糕的是加乙酰膽堿時，腎上腺素并沒有洗掉。這樣出現的結果就是，腎上腺素使得血管收縮，而后加入乙酰膽堿，血管開始舒張!奇怪了!

　　

　　圖1

　　一連三天，David做出的結果都是一樣的。Furchgott很糾結，會不會是兩種獲取標本方式對血管有什么不同的影響?他讓助手拿不同的兩份標本去做組織學檢測。經過一段時間努力，結果出來了，血管平滑肌的襯里——血管內皮有區別。螺旋式的血管條標本幾乎見不到完整的內皮細胞，而血管環狀的標本內皮細胞沒有損傷。難道跟內皮細胞有關?Furchgott發現導致螺旋狀血管條標本內皮損傷的原因可能跟操作過程中反復的摩擦有關。

　　經過大腦飛速的運轉，一個絕妙的試驗計劃在Furchgott的腦中形成。很快實驗就做完了，結果很漂亮。

　　具體說來，這個實驗是這樣的：

　　一是實驗設想，內皮細胞有無是舒張效應的關鍵嗎?為什么刺激內皮細胞可以引起血管平滑肌舒張?會不會是內皮細胞受刺激后釋放某種物質擴散到平滑肌并導致其舒張?

　　二是實驗設計，分為四步。第一，正常的血管環標本摩擦前后的比較;第二，正常血管環用膠原酶處理前后的比較，看化學損傷;第三，如圖2，三個血管環標本，1號去除內皮，2號含內皮，3號是把前兩個并排掛在一起，且內膜相對。這也是后來被廣泛稱道的“三明治血管灌流模型”。結果1號，沒有舒張，因為沒有內皮;2號，有舒張，因為內皮完整;3號也有舒張，說明內皮完整的那個血管條受刺激后釋放了某個東西使得臨近的血管也舒張。

　　第四步實驗，Furchgott還觀察了缺氧和有氧情況下血管條的反應，發現缺氧時，即便內皮完整，血管條也不舒張。多年之后，人們終于證明內皮細胞釋放的就是NO，而NO生成需要氧氣時，不得不感慨Furchgott當年實驗的精妙，竟然如此“鬼斧神工”!

　　

　　圖2

　　拿到實驗結論的Furchgott很激動，他決定把這個結果投到《Nature》。

　　題目是：“The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine”.內皮細胞是乙酰膽堿誘導動脈平滑肌舒張的必要因素。

　　Furchgott是一個很老實很本分的人，他一輩子也沒玩什么先進的科研技術，要知道當時的分子生物學、轉基因等等可是熱火朝天啊。而他老人家幾十年如一日的擺弄著“離體血管灌流裝置”，雖然有些成就，可是激動人心的進展并不多。原本想著再干個幾年就可以退休了。現在，他感到這些結果里面蘊含著驚天動地的秘密。所以，他終于決定試一試這個他以前都不曾想過的雜志。那時，投稿基本還是郵寄，Email還沒有來得及普及。幾周過去了，Furchgott 盼來了一封退稿信，兩個審稿人的意見都是不予刊出，因為他提出的內皮細胞釋放了某東西并不知道是什么玩意兒，太玄乎了。如果按照以前，退了就退了，老實的他不會多做爭辯，換個雜志就是。可這一次，他再也忍不住了。他給編輯部寫了一封信，請求編輯再另選一個審稿人。這一次他遇到知音，第三個審稿人正好也是做血管的，他看到Furchgott的結果很興奮，隨即通知編輯部接受了這篇稿子。

　　這時，那個內皮釋放的東西還沒有名字，正式有名字了是來源于一篇1982年PNAS的文章。在這篇工作里，Furchgott發現一種叫緩激肽的物質跟乙酰膽堿的作用類似，內皮釋放的導致平滑肌舒張的那個玩意還是照例來了。Furchgott給這個蒙面者取了個名字叫“endothelium- derived relaxing factor”，即EDRF。

　　隨后，EDRF的研究、血管內皮的研究開始風靡全球。EDRF的真實身份是什么呢?Furchgott很糾結也很興奮，他孜孜不倦的工作著，雖然進展不多始終未能窺得EDRF的廬山真面目，不過根據蛛絲馬跡，他猜測這是小分子的脂溶性很好的物質，根據硝酸甘油類的藥物提示，有可能是NO。答案很快就會知道!

　　1986年夏季，美國實驗生物學會在明尼蘇達州的Rochester舉行了一次研討會，第一個報告人是Furchgott，他匯報了自己的工作進展，最后他說EDRF有可能是NO。第二個上臺的是Louis J. Ignarro，他贊同Furchgott的觀點，也認為EDRF是NO，并且拿出了一些側面證據，比如含硝基的藥物和乙酰膽堿誘導的EDRF都能使血管平滑肌中的一種叫cGMP的物質升高而不是cAMP，并且都出現血管舒張反應。此前cAMP作為腎上腺素的第二信使被發現的工作，讓另一位美國科學家 Earl Wilbur Sutherland 獲得了1971年的諾貝爾獎，不過此時他已經辭世。

　　EDRF和NO的化學性質十分相似，例如EDRF性質不穩定，半衰期約是3-5秒，可以被超氧陰離子滅活，超氧化物歧化酶能使EDRF的半衰期延長到30 秒。和血紅蛋白(Hb)相互作用前，Hb的最大吸收峰在433nm， EDRF和血紅蛋白(Hb)相互作用后， Hb的最大吸收峰移動到406nm。NO和Hb反應時也同樣具有上述變化。Ignarro成了故事的男二號。

　　說者無意聽者有心!臺下有一位觀眾叫Salvador Moncada，來自英國。他的研究領域是阿司匹林和前列腺素等方面，此前他也曾猜測EDRF會不會是一種新型的前列腺素。現在他知道怎么做了，會議還沒結束他就匆匆忙忙回到了英國，他要精確的證明EDRF就是NO，而不只是猜測!很快，他的團隊做到了。他的精妙實驗結果刊在了次年的Nature上。

　　具體說來，Moncada的實驗是這樣設計的。他把培養的血管內皮細胞吸附在微載體上，裝柱后用緩沖液洗脫;洗脫液以不同時間間隔作用去除了內皮細胞的主動脈血管條以檢測EDRF的生物活性(看血管條是否舒張)，同時用化學發光法檢測流出液NO的含量。并且把流出液與硝酸甘油的藥理作用定量對比。結果發現，由緩激肽(BK)誘導內皮細胞釋放的EDRF，不僅與NO在生物活性、半衰期等生物學特征上完全一致，而且可以被同樣的藥物阻斷劑或激動劑抑制或增強!

　　非常完美的實驗!隨后，Ignarro也在PNAS上證明了EDRF就是NO，并且它還可以使cGMP升高。看起來，Ignarro好像晚了一步。

　　其實這時不應該忘記我們的男三號，Ferid Murad 。他是一位臨床藥理學家，大部分時間研究硝酸甘油的藥理作用。他發現疊氮類化合物和硝酸甘油類藥物能使血管平滑肌的cGMP大量生成，直接NO氣體灌入作用效果類似，而cGMP是由鳥甘酸環化酶(GC)催化產生，如果事前抑制住GC，NO即使升高了，cGMP也不會增多。所以，整個故事就明白了。如圖3所示。

　　

　　圖3

　　乙酰膽堿激活了內皮細胞表面的受體，通過一系列的信號傳遞，激活了產生NO的酶，NO生成后擴散穿越到下層的血管平滑肌細胞，激活了鳥甘酸環化酶，使得cGMP大量增加，最后通過信號傳遞產生舒張血管的效應。

　　隨后，產生NO的酶也被發現了，主要貢獻者是David Bredt 。不同領域的科學家還發現NO有別的功能。Michael Marletta 發現巨噬細胞釋放NO，幫助巨噬細胞消滅病原體。John Hibbs發現巨噬細胞釋放NO的前體物質是L-精氨酸。John Garthwaite 發現谷氨酸能刺激神經細胞釋放NO ，似乎NO還參與神經信號傳遞 。David Bredt 再接再厲發現大腦里有一種特殊型號的NO合酶，即nNOS 。巨噬細胞里的NO合酶比較特殊，正常情況下很少，需要“戰斗”時會增多，就是iNOS，發現者是陳豐原教授的同事，匹茲堡大學的Timothy R. Billiar 教授。

　　總之，NO越來越熱。1992年，NO被Science評選為“年度分子”，并以“No News is Good News”為專題發表了專論，高度評價了NO的發現和偉大意義。終于，在諾貝爾去世100年后的1998年，諾貝爾獎殊榮給了“NO”。獲獎者就是Furchgott、Ignarro和Murad 。消息一公布，英國人覺得很不公平，因為他們的英雄Moncada才是真正第一個證明EDRF身份的人，為此還寫信給諾貝爾獎評委會，不過評委會給出的意見是：諾獎只能授予三個人，如果可以授給四個人，我們會考慮Moncada 。不過怎么說，上帝總歸是公平的。試想想，如果Moncada不去參加那次會議，他還會改變自己的研究方向嗎?從競賽上說，的確是Moncada率先完成了任務。可是科學就是如此，提出想法的人總會得到優先尊重!

　　當然事情到這里還沒有完。藥物開發商輝瑞公司看到了其中的機會。硝酸甘油雖然繼續暢銷。但是它的藥效時間很短，作為心絞痛的急救藥還行，但是很難作為抗高血壓的藥物。輝瑞想從NO的道路里挖點“降壓藥”賣。很快他們把目標鎖定在了cGMP身上。cGMP的半衰期很短，因為一個叫磷酸酯酶的蛋白會把它很快降解掉，這也是為了維持機體的平衡，持續的血管舒展會導致血壓過低引發休克，人就掛了。當然如果是高血壓病人，那就剛好合適。輝瑞針對磷酸酯酶開始漫長了開發流程。苦心人天不負，有一個化合物終于熬到了臨床試驗。不過，壞消息接踵而至。這個化合物的藥效很差，在高血壓病人身上幾乎看不到什么降壓效果，盡管還比較安全。

　　正在輝瑞絕望的時候，眼看數十億美金的投入即將毀于一旦。然而柳暗花明又一村，好消息來了。一組身患糖尿病的40、50歲的男性病人很喜歡吃這個化合物，還主動問試驗醫生索要，盡管他們的高血壓病沒有什么改善。細致的調查員發現了其中的原因。這群病人常年陽痿，吃了這個化合物可以讓他們“重振雄風”。食色性嘛，人之常情，難怪這群人很喜歡這個化合物。

　　輝瑞覺得這是個起死回生的機會，立刻改變藥物的研發方向，把這個化合物做成“壯陽藥”。這個決定也保證了輝瑞直至今天的輝煌。不多久，一個別名叫“偉哥(Viagra)”藥物開始暢銷全球。有了全球男人的“欲望”作保障，“偉哥”簡直成了輝瑞的印鈔機，銷售額股票雙雙看漲!

　　原來，男性陰莖海綿體的磷酸酯酶是另一種型號，不同于別處。偉哥是這個型號磷酸酯酶選擇性的抑制劑，cGMP在偉哥的干擾下，在陰莖海綿體積聚發揮舒張血管的效應，于是海綿體開始充血膨脹——堅挺。由于偉哥跟其他位置的磷酸酯酶結合得并不緊，所以對全身血壓反而沒有什么影響。天意如此，情何以堪!

　　當然，NO的故事遠不止這些。后來發現，硝酸甘油在體內能變成NO，是由一個叫乙醛脫氫酶的蛋白催化的，即ALDH2. 而這個ALDH2本來是催化酒精代謝，讓酒精的中間毒性產物乙醛變成無毒的乙酸。ALDH2有個突變位點，導致酶活力很差，所以ALDH2正常的人能喝酒，適量的酒精對身體的傷害不大。但是對于有突變的人，酒精簡直就是毒品，大量的乙醛會陰魂不散。這種情況在中國人中還特別普遍。ALDH2的突變對于硝酸甘油的藥效也同樣適用。這也是臨床醫生常苦惱的問題，為什么硝酸甘油有的人用起來給力，有些人則不行呢。幾年前，復旦的金力教授和盧大儒教授領銜的課題組，在中國人群中做了硝酸甘油藥效與ALDH2基因型的關系，結果發在了《臨床調查》(JCI)上。

　　與NO一同起步的血管內皮領域也搞得紅紅火火，甚至衍生出《內皮生物學》的分支。其中，日本的科學家做出了很大的貢獻。他們發現了內皮素等多個血管內皮相關的因子。在上世紀90年代初期，還發現了血管內皮的修復干細胞——內皮祖細胞(EPC)，這也是我現在博士期間的研究內容之一。

　　血管內皮細胞還分泌生長因子調節血管的生成，在癌癥中很關鍵，正好碩士期間做過一點這方面的工作。腫瘤與血管新生又有另外一些故事，涉及到新的暢銷藥，我們改天再說吧!

　　參考資料：

　　1.唐小卿 PPT，http://www.docin.com/p-43707961.html

　　2.1998年諾貝爾醫學或生理學獎.ppt

　　3.Robert F. Furchgott__The obligatory role of endothelial cells in the relaxation .pdf

　　4.Furchgott__ PNAS_Role of endothelial cells in relaxation of isolated arteries by.pdf

　　5.JPET__Association Between Cylic GMP Accumulation and Acetylcholine-Elicited Rela.pdf

　　6.Moncada__Nitric oxide release accounts for the biological activity of endotheliu.pdf

　　7.Moncada__Pharmacological Reviews__Nitric Oxide_Physiology , Pathophysiology , an.pdf

　　8.PNAS-1987-Ignarro-9265-9.pdf

　　9.Natue__Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochr.pdf

　　10.PNAS-1993-Geller-iNOS_Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide.pdf

　　11.http://www.mirm.pitt.edu/people/bios/Billiar1.asp#

　　12.PNAS-1990-Bredt-Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme.pdf

　　13.http://en.wikipedia.org/wiki/Robert_F._Furchgott

　　14.JCI__ (ALDH2) Glu504Lys polymorphism contributes to the variation in efficacy of sublingual nitroglycerin.pdf