基因轉染與實驗設計原則

磷酸鈣-DNA共沉淀法

核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現時，可使DNA附在細胞表面，利于細胞吞入攝取，或通過細胞膜脂相收縮時裂開的空隙進入細胞內，進入細胞的DNA僅有1%～5%可以進入細胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細胞DNA整合，在細胞中進行穩定表達，基因轉導的頻率大約為10-4，這項技術能用于任何DNA導入哺乳類動物進行暫時性表達或長期轉化的研究。此方法對于貼壁細胞轉染是最常用并首選的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO4、2H2O

加水至100ml pH7.1過濾，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4℃保存。

(5)G418選擇培養基：用含10%胎牛血清的DMEM培養液配制G418，G418濃度為200～ 800mg/L

注意：對受體細胞先做預試驗，選用濃度為在10～14天內能殺死細胞50%以上的最低濃度。

2、操作步驟[方法一]：

(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受體細胞的培養：研究癌基因轉移應選擇不含人類Alu序列的動物細胞系作為受體細胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細胞系等，該細胞有一定自發轉化傾向，一般在轉染前一天接種細胞，接種密度為2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培養，待細胞占50～70%瓶底面積時，用于轉染試驗。

(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備

①將供體細胞DNA和PSV2-neo質粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時向供體細胞DNA液200μl中加入帶基因neo質粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo為1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。

③然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉染受體細胞。

(4)轉染受體細胞

①將處于對數生長期已占瓶底50～70%的受體細胞，在轉染前4小時更換一次新鮮培養基，每瓶5ml(25ml培養瓶)。

②吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養液的細胞瓶中搖勻。

③置37℃ 5% CO2培養24h或更長，使細胞充分吸入DNA-磷酸鈣結晶顆粒。

④更換新鮮培養基，繼續培養24小時，誘導轉染基因的表達。

⑤更換濃度800mg/L的G418選擇培養液進行篩選。同時設有未能轉染的對照細胞。

⑥培養大約3～5天，對照細胞大部分死亡，這時轉染細胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養基，每3～4天更換一次選擇培養基。

⑦2周后對照細胞死亡，在轉染的細胞瓶中可見有抗藥性的細胞克隆出現，待其增大后再進行化和擴大培養，可建立轉化細胞株，并做進一步鑒定。

本實驗要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉染受體細胞，這樣可使受體細胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現明顯的“轉化灶”，也可測出轉入的外源性基因的抗neo的標記。而且還可利用被neo基因導入的受體細胞通過G418選擇培養篩選轉化的細胞建立細胞株。若以獲取“轉化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細胞中提取的DNA導入受體細胞即可，其方法如下：

3、DNA轉染[方法二]：

(1)配制磷酸轉染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用時現配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存備用

加溫水至 1000mL

(2)按前面介紹的方法提取癌細胞DNA。

(3)取供體DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3M混勻。

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。

(5)加入轉染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結)，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現微濁蘭色時，即可用于轉染細胞。

(6)取生長狀態良好處于半匯合階段的對數生長期細胞，在轉染前4小時，更換培養液(5ml/瓶)1次。

(7)轉染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時。

(8)培養：棄去培養液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養2～3周。

(9)檢測：逐日觀察，待出現“轉化灶”后，分離，擴大培養建立轉化細胞株。

脂質體介導DNA轉染法

脂質體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽離子脂質體N-[1-2，3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5～100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1～5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間(2～24小時)。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

1、操作步驟[方法一]：

(1)：取6孔培養板(或用35mm培養皿)，向每孔中加入2mL含1～2×105個液，37℃CO2培養至40%～60%匯合時(匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。

(2)轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液：用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養基稀釋2-50μgLR，終量100μL,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染(如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量)。

(3)轉染準備：用2mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養液。

(4)轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37℃溫箱置6～24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。

(5)其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。

注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

2、快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]：

(1)以5×105細胞/孔接種6孔板(或35mm培養皿)培養24小時，使其達到50～60%板底面積。

(2)在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下：

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。

②旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。

③室溫下放置5～10分鐘，使DNA結合在脂質體上。

(3)棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物，37℃培養3～5小時。

(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養14～24小時，

(5)吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養24～48小時。

(6)用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

穩定的脂質體轉染方法如下：

(1)接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。

(2)DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前(2)、(3)步驟。

(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養48小時。

(4)吸出DMEM，用G418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞篩選法進行。

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DEAE-葡聚糖轉染法

DEAE-葡聚糖介導的轉染，其原理還不清楚，可能是通過內吞噬作用而使DNA轉導進入細胞核，此法只適合暫時轉染實驗，轉染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時間的長短很有關系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時間(30分鐘-1.5小時)，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長時間(8小時)。

方法如下：

(1)接種鼠L成纖維細胞濃度為5×105CO2/孔/皿生長2～3天，當達50%板底面積可用。

(2)乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo質粒DNA，空氣干燥后溶于40μL的TE中，或取供體DNA。

(3)用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生長因子血清的DMEM洗板(皿)。

(4)在80μl熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細胞中，使其分布均勻輕輕轉動直到顯示均勻一致的紅色，培養4小時。

(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1×PBS洗一次吸出，加入10mL培養液(10%血清的DMEM)。

(6)培養細胞，在適當時間分析細胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養液培養，方法同前。

眾所周知，科研工作者在進行醫藥方面的科學研究之前，需要制定完善的統計研究設計方案，那么什么樣的設計方案才稱得上是完善的呢? 一般來說，完善的設計方案需具備以下幾個條件：實驗所需的人力、物力和時間資源;實驗設計的“三要素”和“六原則”均符合專業和統計學要求，對實驗數據的收集、整理、分析等有一套規范的規定和正確的方法。而其中準確把握統計研究設計的“三要素和六原則”，是科學實驗設計的核心。

實驗設計的三要素和六原則

一、實驗設計的“三要素”

1) 實驗對象。實驗所用的材料即為實驗對象。如用小鼠做實驗，小鼠就是本次實驗的實驗對象，或稱為受試對象。實驗對象選擇的合適與否直接關系到實驗實施的難度，以及別人對實驗新穎性和創新性的評價。一個完整的實驗設計中所需實驗材料的總數稱為樣本含量。最好根據特定的設計類型估計出較合適的樣本含量。樣本過大或過小都有弊端。

2) 實驗因素。所有影響實驗結果的條件都稱為影響因素，實驗研究的目的不同，對實驗的要求也不同。影響因素有客觀與主觀，主要與次要因素之分。研究者希望通過研究設計進行有計劃的安排，從而能夠科學地考察其作用大小的因素稱為實驗因素(如藥物的種類、劑量、濃度、作用時間等);對評價實驗因素作用大小有一定干擾性且研究者并不想考察的因素稱為區組因素或稱重要的非實驗因素(如動物的窩別、體重等);其他未加控制的許多因素的綜合作用統稱為實驗誤差。最好通過一些預實驗，初步篩選實驗因素并確定取哪些水平較合適，以免實驗設計過于復雜，實驗難以完成。

3) 實驗效應。實驗因素取不同水平時在實驗單位上所產生的反應稱為實驗效應。實驗效應是反映實驗因素作用強弱的標志，它必須通過具體的指標來體現。要結合專業知識，盡可能多地選用客觀性強的指標，在儀器和試劑允許的條件下，應盡可能多選用特異性強、靈敏度高、準確可靠的客觀指標。對一些半客觀(比如讀pH試紙上的數值)或主觀指標(對一些定性指標的判斷上)，一定要事先規定讀取數值的嚴格標準，只有這樣才能準確地分析自己的實驗結果，從而也大大提高了自己實驗結果的可信度。

二、實驗設計的“六原則”

1)隨機原則：即運用“隨機數字表”實現隨機化;運用“隨機排列表”實現隨機化;運用計算機產生“偽隨機數”實現隨機化。 盡量運用統計學知識來設計自己的實驗，減少外在因素和人為因素的干擾。

2)對照原則：空白對照組的設立——只有通過對照的設立我們才能清楚地看出實驗因素在當中所起的作用。當某些處理本身夾雜著重要的非處理因素時，還需設立僅含該非處理因素的實驗組為實驗對照組;歷史或中外對照組的設立一一這種對照形式應慎用， 其對比的結果僅供參考，不能作為推理的依據;多種對照形式同時并存。

3)重復原則：所謂重復原則，就是在相同實驗條件下必須做多次獨立重復實驗。一般認為重復5次以上的實驗才具有較高的可信度。

4) 平衡原則：一個實驗設計方案的均衡性好壞，關系到實驗研究的成敗。應充分發揮具有各種知識結構和背景的人的作用， 群策群力，方可有效地提高實驗設計方案的均衡性。在實驗設計的過程中要注意時間上的分配，只有在時間上分配好了，才不會出現一段時間特別忙而一段時間特別閑的情況。

5) 彈性原則：所謂空格，指的是在時間分配圖上留有空缺。適當的空缺是非常必要的，只有這樣才能富有彈性的實施實驗計劃，并不斷地調整好自己的實驗進度。

6) 最經濟原則：不論什么實驗，都有它的最優選擇方案，這包括在資金的使用上，也包括人力時間的損耗上，必要時可以預測一下自己實驗的產出和投入的比值，這個比值越大越好，當然是以你所擁有的實驗條件作基礎的。