地高辛配基隨機標記DNA探針

1.標記DNA探針　每次標準的反應可標記10ng至3μg線性的DNA，也可標記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應增加。

(1)DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

(2)取Eppendorf管(1.5ml)置于冰上，加下列及試劑：

新鮮變性的DNA 　　　　　　　　　1-3μg

六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　2μl(管5)

dNTP標記用混合底物 　　　　　　　2μl(管6)

加無菌重蒸水至　　　　　　　　　 19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow)　　　1μl(管7)

(3)在37℃保溫至少60min，可到20h。

(4)煮沸5min，終止反應。

(5)15000rpm離心30s，置于冰上待用。

2.預雜交　按100cm2膜用20～40ml預雜交溶液，預雜交時使溶液處于流動狀態。

預雜交液組成：5×SSC

0.5%(W/V)封阻試劑(管11)

0.1%(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%(W/V)SDS

膜放入塑料袋，灌入預雜交液，排除氣體后密封，在65℃預雜交過夜。

3.雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。

雜交液組成： 50%甲酰胺(V/V)

5%(W/V)封阻試劑

5×SSC

0.1(W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%(W/V)SDS

新變性標記DNA(150ng/ml)

雜交液取代預雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜(16～20h)。

4.洗膜　　按100cm2膜用250ml洗膜液計算。

(1)在室溫下用2×SSC/0.1%(W/V)SDS溶液漂洗，5min，2次。

(2)在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

(3)在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

5.免疫測定

(1)配制溶液

緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應預早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。

緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液(管9)和35μlX-磷酸鹽緩沖液(管10)。

2. 顯色過程

A.膜在緩沖液1中短暫洗滌(1min)。

B.在100ml緩沖2中保溫30min。

C.再用緩沖液1短暫洗滌。

D.用緩沖液1稀釋的抗體結合物(管8)至150U/L(1:5000);稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12h。

E.膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30min。

F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結合的抗體結合物,15min,2次。

G.膜在緩沖液3中平衡2min。

H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內密封或放入合適的盒子內,幾分鐘內開始出現顏色,一般顯色反應在1天后全部完成。當顏色顯影時，不可振蕩或攪拌。

I.當要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應。

J.攝相。

說明：上述各反應均在室溫下進行，除了顯色反應外，均需振蕩或攪拌。

(五)排除實驗中問題的方法

1.DNA不能有效地被標記時考慮

(1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。

(2)標記反應的保溫時間延長(增至20h)。

(3)DNA變性或許不完全，這時對大片段DNA特別重要。

2.不能達到預期的靈敏度時考慮

(1)DNA標記率。

(2)增加標記DNA的濃度或增加雜交時間。

(3)顯色反應的時間可延長至3d。

3.若顯色時背景過深，可采取

(1)在雜交溶液中減少標記DNA量。

(2)增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。

(3)某些類型的尼龍膜可能產生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。

(4)在雜交和檢測過程中增加封阻試劑的濃度。