干貨來襲—— 跟金域學習臨床LC-MS/MS方法的開發和驗證

　　近年來，質譜技術的快速發展及其高靈敏度、高特異性和高準確度的特點，使得其在臨床檢驗中得到的關注越來越多，應用也越來越廣泛。液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）由于其適用分析的化合物范圍廣泛（極性和非極性化合物），且一次分析可檢測多個化合物，獲得豐富的化合物結構信息，是目前在臨床領域應用最廣泛的質譜技術，已廣泛應用于遺傳代謝病檢測、毒理和濫用藥物監測、治療藥物監測、類固醇激素檢測、營養素檢測等多個方面。

　　臨床LC-MS/MS檢驗的對象，均為存在于生物樣本（如血漿、血清、全血、尿液、唾液、膽汁、組織等）中的生物標志物，生物樣本基質的高度復雜性使得臨床LC-MS/MS方法的開發與驗證具有其自身的特殊性，那么，如何開發建立穩定的、適用于臨床應用的LC-MS/MS方法？金域臨床質譜檢測中心為大家支招：

　　LC-MS/MS分析方法用于臨床常規檢驗之前，必需進行條件優化和性能驗證，分為方法開發和驗證兩個主要方面。

　　方法開發的過程包括：文獻檢索、質譜方法建立、液相方法建立和前處理方法建立四大步。

　　第一，文獻檢索。文獻檢索過程要解決的問題包括：

• 目標化合物的化學結構信息和理化性質；
• 目標分析物的臨床意義；
• 分析物檢測所需的生物樣本類型（血清、血漿、尿液、全血）；
• 分析物在生物樣本中的存在形式及有無其他代謝物、分析物的預期濃度范圍；
• 采用LC-MS/MS方法相對于目前現存的其他方法存在的特點；
• 目標分析物檢測所需LC-MS/MS的質譜方法、液相色譜方法和前處理方法的概況；
• 準備方法開發所需檢測儀器、輔助設備、相關耗材及試劑等。其中，對于分析方法需要關注以下內容：

　　（1）樣品前處理方法：樣品類型、樣品量、處理方法的選擇，需要考慮樣品處理的效果、試劑、耗材及時間成本；

　　（2）質譜方法： 離子化方式、質量分析器的選擇、儀器型號、掃描方式的選擇、離子檢測通道及相應質譜參數；

　　（3）液相色譜方法：色譜柱的選擇、流動相的組成、洗脫方式、進樣量。

　　第二，質譜方法建立。質譜方法建立需完成以下步驟：

• 配制純標準溶液進行質譜掃描，根據目標分析物的極性大小選擇合適的離子化方式（ESI、APCI、APPI等），并確定正負離子模式；
• 確定定性定量離子對，在實現分析方法特異性和靈敏度要求的基礎上，最好選擇兩個以上質譜響應高、選擇性好、穩定性好的特征碎片離子分別作為定量和定性離子；臨床LC-MS/MS方法大多為定量檢測，通常采用多反應監測（MRM）或選擇性反應監測（SRM）掃描方式；
• 確定合適的離子源參數和掃描參數。

　　第三，建立液相色譜方法建立。液相色譜方法的建立需要考慮以下內容：

• 色譜柱的選擇，包括填料類型（非極性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，極性固定相氰基、硅膠、氨基等）、色譜柱可耐受PH值范圍（分析物的酸堿性質）；
• 流動相的選擇，包括流動相的純度（超純水、色譜級溶劑）、流動相的種類（甲醇、乙腈、水等）；
• 流動相添加劑的選擇，使用揮發性添加劑（甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等），盡量不要使用不揮發性添加劑（硫酸鹽、磷酸鹽等），防止影響離子化效率，損壞儀器；
• 洗脫方式的優化，包括采用等度洗脫還是梯度洗脫、起始溶劑的比例、運行時間、柱溫、進樣體積等；考慮到臨床樣本基質的復雜性，盡量選擇梯度洗脫模式。

　　第四，樣品前處理方法建立。生物樣本（如血漿、血清、全血、尿液、唾液、膽汁、組織等）基質的高度復雜性使得臨床LC/MS/MS方法開發過程中，樣品前處理非常重要。樣品前處理具有凈化樣品、提高靈敏度、保護進樣系統、延長色譜柱使用壽命、縮短色譜分析過程、提高檢測通量等優點。樣品前處理方法的建立需要考慮以下內容：

• 常用的生物樣品前處理方法有蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取、衍生化、超濾、水解等，需要根據目標分析物的特點和樣品類型進行合理選擇。
•  一些大型實驗室樣本量較大，可考慮使用自動化前處理，包括Agilent Bravo系統、Online SPE系統等，以達到提高檢測效率，節省成本的目的。但是自動化技術的引進需要考慮到設備的復雜性、成本投入、人員培訓和設備維護以及方法開發的難度，結合實驗室實際情況決定是否引進自動化前處理設備。

　　臨床LC-MS/MS檢驗方法開發建立之后，用于實際臨床檢驗之前，必須對建立的新方法進行嚴格、全面的驗證，證明其分析性能滿足臨床診斷的要求。臨床LC-MS/MS方法驗證的內容包括方法的精密度（批內、批間）、準確度、回收率、分析測量范圍、臨床可報告范圍、分析靈敏度、基質效應、基質特異性、干擾試驗、攜帶效應、生物樣品穩定性、前處理后樣品穩定性、方法參考區間的建立與驗證等，確保可獲得準確、可靠、可重復的結果，為臨床診斷提供合格的數據。

　　方法驗證之后，在日常實際臨床檢驗過程中，需要長期觀察監測分析方法的穩定性，包括分析參數如定量定性離子對的比值變化、分析物和內標的保留時間、峰形等，同時需要采用完善的質量控制措施，包括室內質控、室間質評等質量保證措施，確保檢測結果的準確性和可靠性。

　　 金域檢驗臨床質譜檢測中心 趙蓓蓓

　　2015-11-12