脂溶性維生素的測定
上一篇 / 下一篇 2008-08-16 20:33:07/ 個人分類：食品分析
一、維生素A
目前維生素A都是合成的，來源：(1)從動物肝臟中得到;(2)從維生素前體而得到(維生素前體：主要指類胡蘿卜素，主要是β-胡蘿卜素)
維生素A的測定常用的方法有三氯化銻比色法、紫外分光光度法、熒光分析法、液相色譜法。
對于三氯化銻比色法適用于樣品中含VA高的樣品，方法簡便、快速、結果準確，但是對維生素A含量低的樣品，如每克樣品中含5～10μg維生素A時，這時樣品由于受其脂溶性物質的干擾，不應用比色法測定。
對于紫外分光光度法不必加顯色劑顯色，可直接測定維生素A的含量，對樣品中含VA低的也可以測出可信結果，操作簡便、快速。
1、維生素A的性質
⑴ 因有許多不飽和鏈，故見光易分解;
⑵ 在缺氧情況下，對熱較穩定，對光特別敏感。如測強化奶粉時，速度要快，一般要求測定時間長短，因為時間長，見光時間長，見光分解，故測出的比出廠的含量要少;
⑶ 對堿穩定;
2、測定步驟
⑴ 樣品用有機溶劑萃取脂類
樣品可以根據脂肪的測定處理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取劑，也可用熱苯回流方法提取脂類。如果樣品中含蛋白質和淀粉多的情況下可采用乙醚提取法。
⑵脂類的皂化
脂類有維生素和脂肪這兩部分通過皂化(50%KOH、無水C2H3OH、熱回流)把它們分開，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。
皂化條件：
(1)C2H3OH︰脂類 = 8︰1;
(2)KOH量 = 脂量×皂化價(mg)×2.5;
(3)皂化溫度與時間：70℃、30分鐘
在皂化時可以加入抗氧劑連苯二酚和對苯二酚，防止氧化。
⑶ 提取：不皂化物和皂化物經水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。
⑷ 柱層析分離干擾物質
采用柱層析分離干擾物質，如果柱層析把β-胡蘿卜素也洗脫下來，那么這時維生素A與β-胡蘿卜素就是一個混合物，還要將它們分離開。如果樣品中只有維生素A而不含β-胡蘿卜素時，這時可直接定容。
維生素A與β-胡蘿卜素分離：
吸附劑： 8分中性Al2O3和2分堿性Al2O3混合，裝柱
分離方法：a. 用2%丙酮石油醚洗β-胡蘿卜素;
b. 用乙醚洗VA。
3、測定方法
⑴ SbCl3比色法
維生素A/CHCl3 + SbCl3/CHCl3→形成蘭色物質→在620nm有最大吸光峰
這種蘭色物質不穩定，很快褪色或變成其它物質，所以在分析時最好在暗室中進行，并且做標準曲線。
計算：每百克樣品含VA的量= C×(V1/V2)×(100/W)
C ：從標準曲線上查得VA的量
V1 ： CHCl3定容的量
V2 ： 測定所取樣液體積
⑵ 紫外分光光度法
a. 原理：
VA為脂溶性的，測定VA時必須先將樣品中的脂肪抽提出來進行皂化，萃取不皂化部分，在經柱
層析除去雜質等干擾物質，在紫外328nm下測定，求出含量。
b. 方法
1) 提取及皂化
稱樣10.00g → 于燒杯中 → 加40ml水攪勻 → 移250ml分液漏斗中 → 加氨水5ml → 加乙醇35ml →
搖勻 → 用乙醚抽提(每次40ml抽提三次) → 收集乙醚層 → 用10ml水洗乙醚層三次 →水層再
用30ml乙醚抽提一次 → 合并所用乙醚 → 用索氏法除乙醚→ 待瓶中乙醚除盡后 → 加30ml80%
的KOH → 40mlC2H5OH →加0.8g焦性沒食子酸 → 83℃水浴30分鐘(皂化脂肪)→ 冷卻后移入
250ml分液漏斗中 → 加60ml水 → 用40ml乙醚抽提三次 →合并乙醚抽提液 → 用水洗至中性 →
用索氏法除乙醚 → 除去后用5ml石油醚溶解瓶中內容物 → 然后移入刻度試管中
2)層析
在層析柱內裝8cm高度中性氧化鋁 → 2cm高度堿性氧化鋁及1cm無水硫酸鈉 → 以石油醚浸透 → 裝皂化后的樣液慢慢于柱內→ 用1～2ml石油醚洗試管 → 洗液倒入柱內，活塞打開以每分鐘為35滴左右的速度打開，當液面降到接近硫酸鈉時 → 加5ml石油醚→ 隨后用5ml洗脫液逐次洗滌。
層析柱上第一個黃色層析層，一般是β-胡蘿卜素，此帶在12%洗脫液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黃色為止，此層可測β-胡蘿卜素用，而VA一般在50%洗脫液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸約0.2ml于小試管中→加0.3ml25%三氯化銻→溶液如呈蘭色→表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。
3)樣液測定
以石油醚為空白
4)計算
VA(I.μ100G)=(E×106×2)/(1830×100×W)×(1000/0.3)
0.3 ：每0.3μg VA相當于1 I.μ
E ： 消光值 W ： 樣品重量(g)
1830 ：石油醚中其消光值1%cm為1830
(I.μ)： 一個國際單位，維生素A相當于0.6 μgβ-胡蘿卜素。
4、試劑
⑴ 50%KOH;⑵ 無水硫酸鈉;⑶ 乙醚(不含過氧化氫);⑷ 石油醚;⑸ 苯;
⑹ 45%C2H5OH(應不含醛類物質)
酒精中含醛類的檢查方法：
首先配銀氨溶液，在50%硝酸銀溶液中加入濃氨水，直到氧化銀沉淀又重新溶解為止，在小試管中加2ml銀氨溶液，加3～5滴酒精，搖勻，加10%NaOH 1滴加熱，若有銀鏡反應，表示乙醇中含有醛。
脫醛處理：
取乙醇2000ml → 加AgNO32g → 振搖溶解 → 加NaOH 4g →振搖溶解 → 過濾 → 上清液 → 蒸餾 → 即可
⑺ 20～25% SbCl3的CHCl3
先量取100mlCHCl3于廣口瓶中，用減差法稱取一定量的干燥SbCl3，SbCl3易吸水，所以必需蒸餾重結晶后使用，一般用沙浴上加熱。
二、維生素D
維生素D在魚肝油和雞蛋黃等食品中含量較多，一般成人不會缺VD，而嬰兒容易缺乏。
1、操作步驟
⑴ 提取
樣品(奶粉)+水→混勻 在NH4OH的作用下酪蛋白Ca鹽溶解加入乙醇使脂肪球分離→乙醚、石油醚萃取得到脂質(其它樣品可用索氏提取得到脂質)
⑵ 皂化
在奶粉中脂溶性物質有VD、β-胡蘿卜素、VA、VE、甾醇、脂肪。
目前皂化有三種情況：
低溫(室溫)中溫(70℃±2℃)高溫(100℃15min)
低堿低堿低堿
回收率不完全回收率46%回收率70%
低堿 = 脂肪︰KOH為1︰2.5的關系
另外在皂化時加抗氧化劑與不加抗氧化劑回收率不一樣，加抗氧化劑的回收率高于不加抗氧化劑的回收率。
有人將上面的皂化條件互補，采用中溫-高堿并加抗氧化劑，這樣的回收率為96.8%，效果較好。
故皂化條件 ：70℃±2℃高堿 + 抗氧化劑
⑶ 萃取
⑷ 除甾醇
甾醇在食品中含量較多，主要是通過柱子，這個柱子就是毛地黃皂甙。
甾醇 + 毛地黃皂甙 → 沉淀
洗脫液用乙醚︰己烷 = 1︰5配制而成
甾醇︰毛地黃皂甙 = 1︰14 用量
⑸ 皂土柱層析
當VD與VA共存時，須用皂土柱層析除VA及VA的分解產物。
測定方法有兩種：
比色法：
維生素A/CHCl3 + SbCl3/CHCl3/乙酰氮 → 形成橙黃色物質 → 500 nm下測定
紫外分光光度法
VD/乙醇 → 265 nm下測定